Korean horn beetles, Allomyrina dichotoma (Linnaeus, 1771) reared in many local farms are suffering from a fatal viral disease as reported in 2015, and recent sequencing analysis revealed that the virus is very closely related to Oryctes rhinoceros nudivirus. In a nationwide investigation, it was concluded that the virus can transmit vertically from an infected adult to the offspring by indirect manner, and 70 to 77% of young larvae dead in early stage were diagnosed as this virus positive. Here, we report for the establishment of on-site diagnosis method for the viral disease using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay. A. dichotoma larvae were assayed for the OrNV infectivity with LAMP primers targeting OrNV_gp102 gene. To evaluate the LAMP specificity, two bacterial pathogens, Bacillus thuringiensis and Serratia marcescens, causing disease in A. dichotoma were tested along with OrNV. Only from the OrNV-infected larvae the reaction resulted positive. Also, to avoid DNA extraction process, the LAMP assay used diluted hemolymph directly and 50-fold dilution was set for diagnosis standardization and convenient on-site application for infected larvae from local farms. The LAMP diagnosis is fast and convenient for nontechnical user in the field and expected to stop this foreign virus spread all over the country.

In 2015, we reported a viral disease extremely fatal to Allomyrina dichotoma larvae spread in the majority of the larva-rearing farms in Korea. Currently, the virus-infected larva is diagnosed by PCR-based amplification but this requires laboratory equipment and agarose gel electrophoresis. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), a highly sensitive DNA amplification method, uses DNA polymerase isolated from Bacillus stearothemophilus and a set of six primers. It has great potential for field use because DNA is amplified under single temperature and the overall reaction completes in 30 min without laboratory equipments. Here, we report the development of on-site diagnosis method for Korean horn beetle larva infected by Allomyrina dichotoma Nudivirus.

‘급속면역금나노입자막대 (RIGS) 키트’라 명명된 RIGS 키트는 간단한 면역 흡착막대 방식으로 사용자가 빠르고 편리하게 이용할 수 있으며 토마토덤불위축바이러스 (TBSV)에 대한 현장진단을 하기 위하여 개발되었다. 토끼의 TBSV 항 혈청에서 정제된 면역글로블린G (IgG)는 단백질A 크로마토그래피법으로 정제되었으며 이후 금 나노입자와 결합하여 니트로셀룰로스막에서 진단 선을 표시하도록 고안되었다. TBSV 항체와 비특이적으로 결합하는 단백질A를 같은 진단막대에서 대조선으로 이용되었다. RIGS-TBSV 키트를 이용한 진단은 의심 식물 시료를 완충액이 들어간 플라스틱 봉지에 넣고 착즙후 진단막대기를 넣으면 5-10분 후 결과를 알 수 있도록 고안되었다. TBSV가 감염된 토마토 즙액에 RIGS 막대기를 넣고 진단한 결과 TBSV 농도에 비례하여 진단 선이 형성됨이 관찰되었으며, 이들 키트들은 TBSV와 연관되지 않은 다른 고추 바이러스들에서는 비특이적 반응이 형성되지 않았다. 이런 결과들은 RIGS-TBSV 키트가 TBSV 진단에 다른 어려운 실험이나 기술이 필요하지 않고 쉽게 병원균을 진단 할 수 있다는 것을 의미한다. 그러므로, RIGS-44 TBSV 키트는 TBSV 감염이 의심되는 식물체들의 현장 진단 뿐만 아니라 실험실에서 의 TBSV 진단에 효과적이라 할 수 있다.

‘급속면역금나노입자막대 (RIGS) 키트’라 명명된 빠르며 사용자 편의 및 간단한 면역흡착막대 방식의 키트가 오이모자이크바이러스 (CMV)의 현장진단을 하기 위하여 개발되었다. 토끼의 CMV항혈청에서 정제된 면역글로블린G (IgG)는 단백질A 크로마토그래피법으로 정제되었으며 이후 금나노입자와 결합하여 니트로셀룰로스막에서 진단선 표시하도록 고안되었다.CMV항체와 비특이적으로 결합하는 단백질A를 같은 진단막대에서 대조선으로 이용되었다. RIGS-CMV 키트를 이용한 진단은 의심 식물 시료를 완충액이 들어간 플라스틱 봉지에 넣은 후 착즙 후 진단막대기를 넣으면 된다. 결과는 5-10분 후알 수 있다. CMV가 감염된 고추, 오이 및 멜론의 즙액에RIGS 막대기를 넣고 진단한 결과 CMV 농도에 비례하여 진단선이 형성됨이 관찰되었으며, 이들 키트들은 CMV와 연관되지 않은 다른 고추바이러스들에서 비특이적 반응이 형성되지 않았다. 이런 결과들은 RIGS-CMV 키트가 매우 민감하며,진단에 별 다른 실험실 기술이나 경험이 필요하지 않는 다는것을 의미한다. 그러므로, RIGS-CMV 키트는 CMV 감염이의심되는 식물체들의 현장 진단 뿐만 아니라 실험실에서의CMV 진단에 효과적이다.