제초제 성분인 phosphinothricin을 분해하는 phosphinothricin acetyltransferase (PAT) 단백질을 과발현시킨 제초제저항성 감 자가 개발되었다. 본 연구에서는 안전성평가 기준에 따라, PAT 단백질과 제초제저항성 감자에 대한 급성경구독성 및 아만성 독성 평가를 실시하였다. PAT 단백질을 재조합 대장균에서 분리정제 한 후, ICR계 쥐에 2,000 mg/kg weight 용량의 PAT 단백질을 먹이고 14일 동안 치사율과 체중증가를 관찰한 결과, 죽은 동물이 없었고, 체중증가, 사료 섭취 및 특별한 이상증상을 발견하지 못했다. 아만성 독성의 경우 제초제저항성 감자를 표준사료에 0, 1, 5% 섞어 90일 동안 경구 투여하였다. 이 경우에서도 사망한 개체는 없었으며, 조사한 여러 항목에 대해 특별한 이상증후를 관찰하지 못했다. 또한, 제초제저항성 감자를 먹인 동물군과 대조구로 일반감자를 먹인 동물 사이에서 유의 할 만한 차이는 발견되지 않았다. 이런 결과를 토대로 볼 때, 제초제저항성 감자와 제초제 저항성 단백질인 PAT는 동물에게 독소로 작용하지 않음을 확인하였다.

본 연구는 개량 포플러 현사시 3호를 재료로 제초제 저항성 유전자 PAT으로 형질전환시 킨 다음 제초제 Basta처리에 의한 효율적인 형질전환체 선발을 목적으로 시험되었다. Basta 처리에 따른 캘러스유도, 부정아유도 및 액아유도 시험을 통해 조직치사 농도는 1.0mg/L로 결정할 수 있었으며, 이 농도처리에 의해 형질전환체의 조기선발에 사용하였다. 이 농도처리로 비형질전환체는 모두 고사되었지만, 형질전환체는 정상적으로 반응을 보이며, 생육이 가능하였다 .한편, 형질전환체에 제초제를 직접 살포한 결과, 정상적 생육이 가능했고, PAT activity측정 결과에서도 양성 반응을 나타내어 현사시 3호 세포내에 PAT유전자가 정상 발현됨이 확인되었다. 이로써 현사시에 PAT유전자 도입 및 발현을 위하여 제초제 Basta 처 리와 PAT assay가 매우 효과적인 것으로 나타났다.

제초제 bialaphos에 저항성인 phosphinothricin ace-tytransferase gene이 도입된 형질전환 감자 식물체에서 유전자의 간편한 확인방법을 확립하였다. 먼저 형질전환체와 대조식물체의 잎 disc를 취해 bialaphos 5mg/l를 처리한 액체배지에 치상하였을 때 배양 25일이면 대조식물체의 잎 disc는 완전히 고사되어 형질전환체와 구별이 가능하였다. 감자의 뿌리 생육 비교실험에서는 bialaphos 0.5mg/l의 농도에 agar를 0.6% 첨가한 선발배지에서 식물체의 정단부위를 치상하여 비교하였을 때 7-10일이면 뿌리의 생육차이를 이용하여 간편하게 형질전환여부를 판정할 수 있었다. 또한 감자의 잎 disc를 제초제 bialaphos 0.5mg/l를 처리한 액체배지에 치상하여 15일이 경과한 후 chlorophyll A의 함량을 측정하였을때 형질전환체는 대조식물체보다 2.5배 정도 많은 chlorophyll A를 가지고 있어 형질전환체의 조기 판별시 chlorophyll A함량에 의해 검증이 가능하였다. 한편, 이렇게 형질전환 여부가 확인된 감자 식물체를 이용하여 PAT효소의 활성을 측정한 결과 대조 식물체에서는 PAT효소의 활성을 보이지 않았으나 형질전환 식물체에서는 모두 효소의 활성이 높았다.

This experiment was conducted to introduce phosphinothricin acetyl -transferase(PAT) gene, resistant to basta and non-selective herbidide, into tobacco(Nicotiana tabacum cv.BY4). For shoot formation,tobacco leaf disks were placed on the MS medium supplemented with 2.0mg/L BA and 0.1mg/L NAA. In this medium condition, tobacco leaf disces were cocultivated with A. tumefaciens MP90 containing NPT IIand PAT resistant to kanamycin and Basta, respectively. Shoots were obtained in the medium containing antibiotics, and those were transferred to rooting medium supplemented with 0.1mg/L NAA and antibiotics. The plants obtaining roots were transplanted into soil. Phenotype of transgenic tobacco plant was mostly as normal plant. However, about 5% was abnormal plant, which did not set seeds. PCR analysis and southern blot were performed to determine transformation. As the results, it was confirmed that PAT gene was stably integrated into tobacco genome.When herbicide, basta, was sprayed to the plants confirmed by PCR, the transgenic plants showed normal growth, whereas normal plants died. Therefore, the result of this experiment show that tobacco transformation for the resistance to basta, non-selective herbicide, was successful because PAT gene was stably integrated into tobacco.