Effectiveness of transgene transfer into genome is crucially concerned in mass production of the bio-pharmaceuticals using genetically modified transgenic animals as a bioreactor. Recently, the mammary gland has been considered as a potential bioreactor for the mass production of the bio-pharmaceuticals, which appears to be capable of appropriate post-translational modifications of recombinant proteins. The mammary gland tissue specific vector system may be helpful in solving serious physiological disturbance problems which have been a major obstacle in successful production of transgenic animals. In this study, to minimize physiological disturbance caused by constitutive over-expression of the exogenous gene, we constructed new retrovirus vector system designed for mammary gland-specific expression of the hEPO gene. Using piggyBac vector system, we designed to express hEPO gene under the control of mammary gland tissue specific and lactogenic hormonal inducible goat β-casein or mouse Whey Acidic Protein (mWAP) promoter. Inducible expression of the hEPO gene was confirmed using RT-PCR and ELISA in the mouse mammary gland cells treated with lactogenic hormone. We expect the vector system may optimize production efficiency of transgenic animal and reduce the risk of global expression of transgene.

In this study, to further understand the mechanism of animal growth and to develop a miniature transgenic animal model, we constructed and tested tetracycline-inducible RNAi system using shRNA targeting the mRNA of mouse insulin-like growth factor (mIGF-1) or mouse growth hormone receptor (mGHR) gene. Quantitative real-time PCR analysis of mouse liver cell (Hepa1c1c7) cells transfected with these vectors showed 85% or 90% of expression inhi-bition effect of IGF-1 or GHR, respectively. In ELISA analysis, the protein level of IGF-1 in the cells expressing the shRNA targeting IGF-1 mRNA was reduced to 26% of non-transformed control cells. Unexpectedly, in case of using shRNA targeting GHR, the IGF-1 protein level was decreased to 75% of control cells. Further experiments are needed to explain the lower interference effect of GHR shRNA in IGF-1 protein. Accumulated knowledge of this approach could be applicable to a variety of related biological area including gene function study, gene therapy, development of miniature animals, etc.

Until recently the most popular tetracycline-inducible gene expression system has been the one developed by Gossen and Bujard. In this study, we tested the latest version of same system and the results are summarized as follows: Compared with previous one, the difference of new system are minor changes of nucleotide sequences in transactivator and tetracycline response element (TRE) regions. Sensitivity to the doxycycline (a tetracycline derivative) was improved. Leakiness of GFP marker gene expression in non-inducible condition was significantly decreased. Higher expression of the marker gene was observed when the cells were fed with doxycycline- containing medium. Optimal insertion site of woodchuck posttranscriptional regulatory element (WPRE) sequence which was known to increase gene expression was different depending on the origin of cells. In chicken embryonic fibroblast, location of WPRE sequence at 3’ end of TRE resulted in the highest GFP expression. In bovine embryonic fibroblasts, 3’ end of transactivator was the best site for the GFP expression.

현재 널리 사용되고 있는 목적 유전자 발현 조절 시스템은 Gossen과 Bujard에 의해 개발 된 tetracycline-inducible gene expression system (Tet system)으로서, 유도체인 tetracycline 계열의 물질의 공급 여부에 따라 외래 유전자의 발현을 가역적이며 유도적으로 조절할 수 있다. 이 시스템은 중금속이나 steroid hormone 등을 이용한 발현 조절 시스템에 비해 발 현 유도율이 높고 비특이적인 발현이 상대적으로 낮으며, 유도물질에 의한 세포 독성이나 다 면 적 영향이 거의 나타나지 않는 장점을 가진다. 그러나 비유도 조건에서 완벽한 발현 억제가 이루어 지지 않은 관계로 background 활성이 미미하게 존재하고 있어서 이를 해결하기 위 한 연구가 진행되고 있으며 유도물질에 대한 transactivator의 감수성을 향상시켜서 낮은 유 도체의 농도에서도 유전자의 발현을 극대화하기 위한 시도도 이루어지고 있다. 본 연구에서는 가장 개선된 형태의 Tet system의 각 요소들을 재조합하여 one vector 형 태의 유전자 발현 조절 시스템을 구축한 후, 일차배양한 세포주에서 이 시스템의 효율성을 증명하고자 하였다. 재조합한 요소는 유전자 발현 조절을 위한 Tet system의 구성에 있어 서 가장 중요한 2가지 요소인 transactivator와 tetracycline response element (TRE)로 각 각 의 일부 서열이 변형된 형태이다. 도입한 transactivator는 유도 조건에서의 외래 유전자의 발현을 극대화시키고 발현 유도물질인 doxycycline에 대한 감수성을 높여서 저농도의 doxycycline 조건에서도 발현 유도가 가능하다. 또한, 변형된 TRE 서열에는 endogenous mammalian transcription factor 결합 부위가 존재하지 않으므로 transactivator가 없는 경우 유전 자의 발현이 turn on되지 않으므로 background 활성이 거의 나타나지 않는다. 실제적으로 기존의 Tet system에서는 비유도 조건에서의 외래 유전자인 GFP의 발현을 미미하게 나타 낸 데에 비해 개선된 Tet system에서는 GFP의 발현이 거의 나타나지 않았다. 또한, 유도 조건에서는 기존의 system에 비해 새롭게 구축한 system에서 강한 발현을 나타내었으며 발현 유도율도 매우 높은 것으로 확인되었다. 구축한 Tet vector system에서 WPRE 서열의 위치와 표적세포주의 종류에 따른 GFP의 발현 양상을 확인한 결과, 소의 태아섬유아세포 에서는 WPRE가 transactivator 서열의 3′ 위치에 존재한 vector에서 발현이 가장 강하게 나 타났으며 닭의 배아섬유아세포에서는 WPRE가 TRE 서열의 3′ 위치에 존재한 vector에서 강한 발현을 보였다. 본 연구에서 구축한 개선된 형태의 Tet system은 완벽한 외래 유전자의 발현 조절을 가 능하게 함으로써 세포 수준에서나 개체 수준에서의 관련 연구에 있어서 유용한 유전자 전 이 수단으로 이용될 수 있을 것이다. * 본 연구는 농촌진흥청 차세대 바이오그린21사업(과제번호: PJ007990042012)의 지원에 의해 이루어졌다.

191개의 아미노산으로 구성된 인간 성장 호르몬(human Growth hormone, hGH)은 성장 촉진뿐만 아니라 근육량 증가, 뼈 강화, 체내 지방 분해 등의 약리적 작용을 가지며, 이와 연관된 여러 질환에 대한 치료 및 기타 치료보조제(미용 및 노화억제 분야 등)로 사용되고 있다. hGH를 비롯한 대부분의 단백질 치료제는 98% 이상이 주사제로 투여되고 있는데 이 러한 투여 방식은 환자의 통증 및 감염 가능성 뿐만 아니라 투여 횟수가 많은 경우에는 시 간적, 비용적, 편리성의 측면에서 환자에게 부담이 가중된다. 본 연구에서는 이러한 문제점 을 해결하기 위하여 감염의 우려도 없으며 주사공포증 없이 복용할 수 있는 hGH와 hTf 단 백질을 융합시킨 형태의 경구 투여용 hGH를 생산하고자 하였다. hGH와 hTf 융합 단백질의 유전자 서열은 HepG2 세포에서 분리한 RNA로부터 RT-PCR 을 수행하여 cloning한 hTf 유전자의 서열과 cDNA로 합성한 hGH 유전자 서열을 cyclo peptide linker나 helical peptide linker로 연결하여 retrovirus vector에 도입하였다. 구축한 각 virus vector는 virus 생산 세포주인 GP2 293과 VSV-G 피막단백질 유전자를 이용하여 retrovirus로 생산한 후, 닭의 배아섬유아세포인 CEF와 CHO 세포에 감염시켰다. 각 세포에서 hGH-hTf 유전자의 발현은 RT-PCR, Western blot, ELISA 실험을 통하여 확인하였다. RT-PCR 실험 결과에서는 virus에 감염된 세포주와 감염되지 않은 세포주에서 GAPDH 유전자에 대한 증폭 단편이 확인된 데 반해, hGH 유전자와 WPRE 서열에 대한 증폭은 virus 에 감염된 세포주에서만 이루어 졌다. Virus에 감염된 세포에서 hGH 단백질과 hTf 단백 질의 발현 양상을 확인하기 위하여 각각의 세포 배양액과 세포에서 분리한 단백질을 이용 하여 Western blot을 실시하였다. 세포 배양액과 세포에서 분리한 단백질에서의 hGH와 hTf 발현을 비교한 결과, 두 단백질 모두 세포 배양액에서의 발현이 강한 것으로 확인되었다. hGH 단백질은 약 20 kD의 크기를 나타내었으며 hTf 단백질은 80 kD의 크기를 가지는 것 으로 확인되었다. 각 virus에 감염된 세포에서는 hGH 단백질이 hTf 단백질과 융합된 형태 로 발현되어 약 100 kD의 크기를 가지는 것으로 확인되었다. ELISA 분석 실험에서도 virus 에 감염된 각 세포에서의 hGH 단백질의 발현 및 분비를 확인하였다. 본 연구에서 확보한 경구 투여용 인간 성장 호르몬인 hGH-hTf는 차후 형질전환 동물의 개발이나 물질 생산 세포주의 확립을 통해서 대량생산함으로써 주사용으로만 개발되어 있 는 바이오의약품의 경구용화 관련 연구에 필요한 핵심 기술을 제공할 수 있을 것이다. * 본 연구는 농촌진흥청 차세대 바이오그린21사업(과제번호: PJ00804101)의 지원에 의해 이루어졌다.

Human growth hormone (hGH), one of the most important hormones in medicine, is secreted from anterior pituitary gland. Its broad physiological function includes body growth, cell regeneration, increasement of muscle volume, bone density, body fat reduction, and so on. Due to the wide range of therapeutic effects, the hGH produced from E. coli has been commercialized already. In this study, we asked whether it is possible to produce recombinant hGH efficiently from various cultured mammalian cells. To meet this purpose, we chose a retrovirus vector system for transfer and expression of the hGH gene in various mammalian cells. Analyses of RT-PCR, ELISA, and Western blot to determine expression of the hGH gene showed the highest production of the hGH was determined from chicken embronic fibroblast (CEF) cells with the concentration of 8.58 μg/ml. The biological activity of the hGH was similar to the commercially available counterpart. These results suggest that mass production of hGH is possible not only in the E. coli but also in the various mammalian cells.

hFSH is a glycoprotein secreted from anterior pituitary and consists of α and β subunits. Because of its major biological functions including sperm formation in the male and for follicular growth, FSH is used to cure woman's sterility. In this study we tried to produce recombinant hFSH in vitro using a retrovirus expression vector. Two major components of the vector we constructed are: (ⅰ) a DNA fragment containing α and β genes fused by a DNA sequence coding carboxyl terminal peptide (CTP) of human chorionic gonadotropin, (ⅱ) a DNA fragment corresponding woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE). Evaluation of expression profile of the recombinant FSH using reverse transcription PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Among three cell lines tested, HeLa cells were the best for hFSH expression (5,395 mIU/ml), then followed by chicken embryonic fibroblast (CEF) cells and Chinese hamster ovary (CHO) cells in the order of hFSH production. In addition to the amount, the FSH produced from HeLa cells was highest in terms of biological activity which was determined by measuring cAMP.

The purpose of this study is to establish a basic culture system enabling in vitro culture of chicken blastodermal cells and to test the feasibility of retrovirus-mediated gene transfer to the cultured cells. The blastodermal cells were isolated from freshly laid eggs of stage X and cultured with or without STO feeder layer cells. Stem cell-like morphology was maintained after multiple passages and RT-PCR analysis proved expression of several stem cell specific genes. Immunocytochemical analysis using antibodies of anti-EMA-1 and anti-SSEA-1 also showed the feature of stem cells. Infection of the cultured blastodermal cells with LNCGW retrovirus vector resulted in successful transfer of foreign genes. The results of this study may be useful in establishing stem cell-mediated transgenic chicken production.

In this study we tried to construct a more efficient tetracycline-inducible gene expression system by replacing previous key elements with more advance ones. At the beginning, we substituted PGK (phophoglycerate kinase) promoter for CMV (cytomegalovirus) promoter to control “rtTA2sM2” which has been known for high induction efficiency in response to tetracycline. With this modification, expression of the EGFP marker gene under the induction condition was significantly increased. Next, we replaced “TRE” fragment with a modified version named “TRE- tight” which has been reported to have higher affinity and specificity to the transactivator by minor base change of the “TRE” DNA fragment sequence. Use of “TRE-tight” instead of “TRE” resulted in more than 10 fold increment in terms of induction efficiency and significant decrement of background expression in non-inducible condition. By combining PGK promoter and “TRE-tight” fragment, we could upgrade previous tetracycline-inducible system to show more stringent turn on/off gene switch ability and stronger expression of the gene of our interest. Use of this newly developed system must be very helpful to the studies of gene expression, especially to the transgenic animal study in which non-controllable constitutive expression of the transgene has been one of the urgent problems to be solved.

본 연구는 vesicular stomatitis virus G glycoprotein (VSV-G)으로 피막이 형성되는 replication-defective MoMLV-based vector를 이용한 hTPO 헝질전환 닭의 생산에 관한 연구이다. 실험에 사용한 retrovirus vector의 구조는 hTPO 유전자의 발현 조절을 위해 internal promoter인 hCMV promoter를 이용하였으며 외래 유전자의 발현을 증가시키기 위해 woodchurk hepatitis virus posttranascriptional regulatory element (WPRE) 서열을 도입하였다. 재조합한 vector는 GP2 293 포장세포에 도입하여 virus를 생산하였으며 이 virus를 이용하여 감염시킨 여러 표적세포에서 hTPO의 발현과 생물학적 활성을 확인하였다. 재조합 hTPO의 생물학적 활성은 시판되고 있는 재조합 hTPO에 비해 우월한 것으로 확인되었다. hTPO 형질전환 닭의 생산을 위하여 1,000배 이상 고농도로 농축된 virus를 stage X 단계의 계란의 배반엽 층에 미세주입하여 대리난각 방법으로 배양하였다. 미세주입한 132개의 계란 중 21일 후에 11개의 계란에서 병아리가 부화하였으며 그중 4마리가 형질전환 개체로 확인되었다. 그러나 생산된 4마리 중 3마리가 부화 후 1개월 이내에 원인불명으로 사망하였다. 본 연구의 의의는 상업적 이용 가능성이 있는 생물학적 활성을 가진 사람의 cytokine 단백질의 대량 생산을 위한 생체 반응기로서의 형질전환 닭 개발의 시례를 제공하는데 있다.