Somatic cell nuclear transfer (SCNT) for miniature pig has been developed for xenotransplantation and many other biomedical experiments. However, the efficiency of SCNT is still very low due to many factors. To optimize the surrogate mother condition for improvement of cloned miniature pigs efficiency, we investigated the effect of the status of surrogate mother on pregnancy, farrowed rate in SCNT pigs. After SCNT with mesenchymal stem cells as donor cells, the SCNT embryos were surgically transferred into the oviduct of surrogated pigs. To compare the effects of status of surrogate pigs on pregnancy, surrogate pigs were prepared by artificial abortion at day 20~29 (Group 1), 30~39 (Group 2), and 40~45 (Group 3) of gestation. After SCNT embryos transfer in three different status of surrogate pigs, Group 2 (56.3%) and 3 (55.6%) had significantly ( <0.05) higher the pregnancy rate than group 1 (0%) at day 30 of gestation. The status of ovulation in surrogate pig also was investigated. Post-ovulation status (54.8%) had higher proportion than pre-ovulation status (38.7%) and ovulation status (6.5%). We obtained 19 cloned miniature piglets from seven surrogate gilts and five piglets are living healthy but fourteen piglets died soon after birth or stillbirth. The weights of piglets greatly differ from 254 to 1,296 g. Microsatellite analysis showed that cloned piglets were genetically different from the surrogate mother and cloned piglets were genetically equal to the donor cell. In conclusion, the present result indicates that artificially abortion method can improve the efficiency of pregnancy after SCNT in pigs. This study will provide available method for the further study and application in the field of xenotransplantation.

인간성장호르몬(human growth hormone; hGH)은 뇌하수체 전엽에서 분비되는 호르몬 의 일종으로 단백질 합성을 촉진하고 에너지를 생산해 지방을 분해하며 뼈를 포함한 체 내의 거의 모든 조직의 성장을 자극한다. DNA 재조합 기술이 발달함에 따라 hGH는 신 체의 성장, 골밀도 향상, 체지방 감소, 세포의 재생, 근육량 증가 등에 효과를 보이는 의 약품으로 사용되고 있다. 본 연구에서는 시료 중 함유된 hGH의 효율적인 분리,정제를 위 하여 immunoaffinity chromatography system을 개발하여 hGH를 분리정제하고 그 활성도 를 측정하고자 하였다. 이를 위하여, 단크론성 항체를 생산하는 hybridoma cell line중 hGH에 가장 강한 친화력이 있는 항체를 분비하는 hGH-K-24 세포주를 선별하여 Balb/C 마우스의 복강에 주입하여 복수를 생산, 채취하였고, Protein G를 이용하여 항체를 분리 정제 하였다. 정제한 항체를 CNBr-Sepharose 4B와 결합시켜 immunoaffinity chromatography column을 제작하였고. hGH를 분비,생성하는 CHO세포주를 serum이 없는 상태에 서 10일 동안 배양한 다음 배지를 회수하여 hGH를 immunoaffinity chromatography system으로 정제하였으며, 순수정제도를 높이기 위하여 superdex G-200으로 gel filtration chromatography 하여 target 단백질인 hGH만을 분리하는 일련의 과정을 확립하였다. 또 한, hGH의 역가를 알아보기 위하여 NB2-11 cell을 이용하여 MTT assay를 통한 활성도 를 살펴보았다.

Porcine beta casein promoter를 이용하여 형질전환 동물에서 유선특이적으로 목적 단 백질을 발현시킬 수 있는 pPBC 벡터를 구축하였으며 이 벡터를 이용하여 보다 높은 농 도의 목적 단백질을 발현 시킬 수 있도록 pPBC 벡터 개량을 시도하였다. pPBC 벡터의 5'arm 부위를 5428 bp, 4419 bp, 3378 bp의 길이로 잘라 서로 다른 크기의 5’arm을 갖 게 하였으며 5’arm의 5’ 쪽으로 CMV enhancer를 삽입하였다. 또한, porcine beta casein promoter 조절 하에 hGH(human growth hormone) 유전자를 발현하도록 하는 벡터를 구 축한 후 세포주 및 형질전환 마우스에서 발현 양상을 확인하였다. 개량된 pPBC 벡터를 이용하여 mouse mammary gland epithelial cell line HC11에서 luciferase assay를 통해 각각의 벡터에 대한 활성을 확인한 결과, 5’arm 길이가 가장 짧고 CMV enhancer가 삽입 된 CMV-pPBC p-3378 벡터에서 활성이 가장 높게 나타났다. 이 벡터를 이용하여 hGH 유전자와 mRNA를 안정화시켜 유전자의 발현을 증가시킨다고 알려진 woodchuch hepatitis virus post-transcriptional regulator element (WPRE)를 함께 삽입하여 CMV-pPBC p-3378-hGH-WPRE 벡터를 구축하였다. 이 벡터로 transgenic mice를 생산하여 유선을 포함한 여러 조직으로부터 hGH의 발현을 RT-PCR 방법을 확인하였다. 그 결과 liver와 lung에서는 아주 약하게 hGH가 발현을 하였으나 유선 조직에서 hGH가 가장 많이 발현 하는 것을 볼 수 있었다. 형질전환 마우스 유즙 내의 hGH 발현을 western과 ELISA를 이 용하여 확인한 결과, 유즙 내에는 약 22 kDa의 hGH가 존재 하였으며 ml 당 최고 50 100 ug의 농도로 hGH를 포함하고 있었다. 이러한 결과들은 개량한 pPBC 벡터가 유선특 이적인 발현을 하며, 유선 세포주에서는 높은 활성을 나타냈지만 형질전환 마우스의 유 즙에서는 개량전의 벡터 보다 낮은 수준의 목적 단백질을 생산하여 서로 상이한 결과를 나타내었다. 따라서 앞으로도 유선특이적 발현 벡터인 pPBC 벡터의 개량 연구를 계속 진행할 것이다.