조직 플라스미노겐 활성제(Tissu-type plasminogen activator; tPA)는 혈전 용해제로 이용되고 있으며, 주로 심근경색증과 같은 급성 혈전후성 허혈증 등을 치료하는 데 유용하다. 본 연구에서는 혈관 질환 치료제를 생산하기 위하여 체세포 복제를 이용한 htPA 를 발현하는 형질전환 복제 돼지를 생산하였다. 형질전환 복제란 8,026 개를 25 두의 대리모에(321 개/1 두) 이식하였으며, 25 두 중 6 두의(24%) 대리모가 자연분만으로 19 두의(3.2 두/1 두) 산자를 생산하였다. 19 두 중 1 두가(1/19 두, 5.3%) 생존 중에 있으며, 8 두는 사산 개체였고(8/19 두, 42.1%), 10 두는 출생 후 2-3 일내에 폐사하였다(10/19 두, 52.6%). 폐사 개체들은 혀 기형, 구개열 등 안면기형이 관찰되었으며, 이와 함께 관절 혹은 발굽의 모양이 비정상적이라는 것을 확인하였다. 또한, 폐사개체들은 모두 하나 이상의 문제점을 동시에 가지고 있음을 확인하였다. 따라서, 이러한 문제점들이 형질전환에 의한 것인지, 아니면 복제에 의한 것인지를 규명하기 위해 연구를 더 진행해야 할 것으로 사료된다.조직 플라스미노겐 활성제(Tissu-type plasminogen activator; tPA)는 혈전 용해제로 이용되고 있으며, 주로 심근경색증과 같은 급성 혈전후성 허혈증 등을 치료하는 데 유용하다. 본 연구에서는 혈관 질환 치료제를 생산하기 위하여 체세포 복제를 이용한 htPA 를 발현하는 형질전환 복제 돼지를 생산하였다. 형질전환 복제란 8,026 개를 25 두의 대리모에(321 개/1 두) 이식하였으며, 25 두 중 6 두의(24%) 대리모가 자연분만으로 19 두의(3.2 두/1 두) 산자를 생산하였다. 19 두 중 1 두가(1/19 두, 5.3%) 생존 중에 있으며, 8 두는 사산 개체였고(8/19 두, 42.1%), 10 두는 출생 후 2-3 일내에 폐사하였다(10/19 두, 52.6%). 폐사 개체들은 혀 기형, 구개열 등 안면기형이 관찰되었으며, 이와 함께 관절 혹은 발굽의 모양이 비정상적이라는 것을 확인하였다. 또한, 폐사 개체들은 모두 하나 이상의 문제점을 동시에 가지고 있음을 확인하였다. 따라서, 이러한 문제점들이 형질전환에 의한 것인지, 아니면 복제에 의한 것인지를 규명하기 위해 연구를 더 진행해야 할 것으로 사료된다.

이종이식 시 사람과 돼지는 면역학 적으로 일치하지 않으므로, 면역세포의 활성화 및 조직의 병변 등을 유발한다. 특히, 영장류에는 존재하지 않고 돼지의 전 조직에서 발현되는 alpha-gal 인자에 의해, 이종이식 시 alpha-gal 항원에 대한 항체의 급격한 증가로 거부반응이 유발되며 영장류를 사망에 이르게 한다. 이에, 본 연구는 alpha-gal 합성에 관여하는 효소인 alpha-galactosyltransferase를 knock out(Gal-/-)한 돼지의 세포를 기반으로, 보체의 활성을 조절하는 membrane cofactor protein(MCP)과 혈액 응고를 저해하는 thrombomodulin(TBM)의 과발현을 유도하고자 하였다. 이는, 이종이식 시 발생하는 염증반응과 혈액응고 현상을 억제하는 복합형질 전환 돼지를 개발함으로 이종이식 후의 생존성 향상에 기여하고자 하였다. 따라서 codon modification 을 통해 염기서열을 변형한 MCP cDNA 는 CAG 프로모터를 이용하여 전 조직에서 발현되도록 하였고, TBM 은 Icam2 프로모터를 통해 혈관 내피세포 특이적인 발현을 유도하였다. 제작된 벡터를 Gal-/- 돼지의 섬유아세포에 도입하고 MCP 발현 수준이 높은 세포를 선별하여 세포주를 구축하였다. 구축된 체세포를 이용하여 체세포 복제란을 생산하고 외과적 방법으로 수란 돈에 이식하였다. 체외성숙(78%) 한 난자를 복제 및 융합(58%)한 후 4 두의 대리모에 각각 약 310 개의 복제란을 이식하였다. 대리모 1 두에서 임신(25%) 및 분만(25%)에 성공하였으며, 9 두의 산자 중 6 두가 생존하고 3 두는 사망하였다. 본 연구에서 생산된 TBM 유전자가 도입된 형질전환 복제돼지는 증식과정을 통해 축군을 조성하고 향후 영장류를 활용한 이종이식 연구에 활용될 예정이다.

This study was conducted to investigate the effects of donor cell treatments on the production of transgenic cloned piglets. Ear fibroblast cell obtained from NIH MHC Inbred minipig was used as control. The GalT knock-out/CD46 knock-in (GalT/CD46) transgenic cell lines were established and used as donor cells. The reconstructed GalT/CD46 embryos were surgically transferred into oviduct of naturally cycling surrogate sows (Landrace × Yorkshire) on the second day of standing estrus. Unlike control (1.2 kV/cm,, 75.4%), the fusion rate of the GalT/CD46 donor cells was significantly higher in 1.5 kV/cm, (84.5%) than that of 1.25 kV/cm, (20.2%) (p<0.01). When the number of the transferred embryos were more than 129, the pregnancy and delivery rates were increased to 13/20 (65%) and 5/20 (25%) compared to less than 100 group [1/6 (16.7%) and 0/6 (0%)], respectively. To analyze the effect of donor cell culture condition on pregnancy and delivery rates, the GalT/CD46 donor cells were cultured with DMEM or serum reduced medium. In serum reduced medium group, the pregnancy and delivery rates were improved to 8/12 (66.7%) and 5/12 (41.7%) compared to DMEM group [3/7 (42.9%) and 0/7 (0%)], respectively. In conclusion, it can be postulated that an appropriate fusion condition and culture system is essential factors to increase the efficiency of the production of transgenic cloned piglets.