본 연구는 참굴(Crassostrea gigas)의 패각운동을 이용하여, 연안역에서 발생하는 저염수에 대한 조기경보가능성을 살펴보았다. 30 psu와 20 psu에서 패각운동은 각각 7.32±3.21회/hr와 7.11±3.90회/hr였으며, 파형과 횟수는 차이가 없었다(t-test, p>0.001). 하지만 10 psu와 5 psu 에서는 모든 개체가 폐각상태를 지속하였다. 수온과 염분의 복합실험결과, Group 1(수온 15 ×염분 15 psu)은 20 30 psu에서 보인 패각운 동 후(약 2 3시간), 장시간 폐각을 하였다. Group 2(수온 30 ×염분 15 psu)에서는 Group 1의 패각 개폐운동보다 더 빠르고 자주 나타나, 참 굴의 생리적인 위기상황에 대한 신호를 나타내었다. 따라서 이러한 파형은 하계 저염수 출현 시 나타낼 수 있는 조기경보 신호로 충분히 활용될 수 있을 것으로 보인다.

이상 고수온을 감지하기 위한 생물모니터링 시스템(BMS) 연구를 위해, 4단계의 수온(5, 10, 20와 30℃)에서 참굴 패각운동을 측정하였다. 모든 참굴은 실험시작 전에 3일 동안 절식을 통하여, 먹이섭이 및 배출에 따른 패각운동의 요인을 제거하였다. 5℃ 실험구에서는 패각운동이 관찰되지 않았지만, 수온의 증가와 함께 패각운동은 증가하였다(10℃ : 6.31±2.18 times/hr, 20℃ : 22.0±10.0 times/hr). 30℃에서는 5℃와 같이 패각운동이 전혀 보이지 않았던 실험구와 20℃와 유사한 패각운동이 실험구가 나타났다. 이는 30℃ 이상에서도 20℃와 같은 신진대사를 보이는 개체군이 있었으나, 대부분이 신진대사의 활력의 감소에 기인하여 폐각상태가 지속되는 것으로 나타났다. 따라서 참굴 양식장에 고수온 감지를 위한 참굴 패각운동 BMS를 설치한다면, 경계단계는 빠른 패각운동(약 30.0회/hr 이상)일 때, 심각단계는 수시간 이상 폐각상태일 때, 조기경보(early warning)를 내릴 수 있을 것이다. 따라서 참굴 패각운동을 활용한 BMS는 이상고수온의 조기경보에 대하여 효과적으로 활용이 가능할 것으로 판단된다.

본 연구는 소형화된 홀 소자를 이용하여 국내 패류 양식 생물 중 가장 많은 생산량을 보이는 참 굴(Crassostrea gigas)의 패각운동을 기초로, 연안역에서 빈산소에 대한 생물모니터링 시스템의 적 용 가능성을 조사하였다. 정상상태 패각운동의 측정을 위해서 여과해수에서 측정한 결과, 참굴 개 체는 평균 5~12 mm 정도의 개각상태를 유지하였으며, 패각운동 시 비교적 빠른 폐각상태를 보 였다가 느린 속도의 개각상태의 운동이 관찰되었다. 하지만, 주 · 야간 사이에는 큰 차이가 없었다 (p <0.05). 용존산소 농도를 7 mg l-1에서 3 mg l-1까지 감소시키면, 패각운동의 횟수는 증가를 나 타내었으며, 파형도 정상상태와 다르게 불안정한 파형을 보였다. 또한 용존산소가 2 mg l-1로 감 소된 후에는 패각운동의 크기가 점차 작아지거나, 폐각상태를 지시하는 파형이 관찰되었다. 이와 같은 생물모니터링 시스템을 패류 양식에 활용하여 빈산소와 같은 해양환경의 이상변동을 신속히 감지할 수 있다면, 어업피해를 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다.

나노입자란 직경 100nm 이하의 크기를 가진 입자로 가전, 기능성 화장품, 반도체, 항균제 및 광촉매제 등에 널리 사용되어 있어 본 연구는 9종류의 나노입자가 참굴 수정란에 미치는 영향을 살펴보았다. 나인입자를 첨가하지 않은 대조구에서는 인공 수정한 참굴 수정란의 78%가 D형 유생으로 발생하였다. 은(Ag)이 2% 함유된 AGZ020, Nano silver 및 P-25의 나노입자와 주석산화물인 SnO의 나노입자는 24시간 경과 후 0.05ppm 농도에서 각 각 22%, 52%, 58% 및 76%가 D형 유생으로 발생하였으나, 20ppm 농도에서 8시간 이내 참굴 수정란을 모두 파괴하였다. In, Sb, Sn, Zn 및 Ag-TiO2의 나노입자는 24시간 경과 후 0.05ppm 농도에서 모두 70%이상의 D형 유생으로 발생하여 상대적으로 낮은 농도에서 큰 영향을 받지 않는 것으로 나타났으나, 20ppm 농도에서 대조에 비해 D형 유생 발생율이 각 각 57%, 60%, 50%, 65% 및 64%로 저해되었다.

참굴 Crassostrea gigas는 우리나라의 매우 중요한 양식패류로 연간 양식에 필요한 종묘는 약 1,800만연 이상으로 대부분 자연채묘에 의한 천연종묘로 공급되고 있으며, 이중 10~15%를 인공종묘로 사용하고 있다. 그러나 인공종묘의 여러 가지 장점에도 불구하고, 천연종묘보다 생산단가가 높은 단점이 있다. 따라서 경제성이 있는 우량한 인공종묘의 생산, 보급을 위한 연구가 시급하다. 인공종묘의 생산단가를 줄이기 위해서는 우선 모패의 사육관리에 소요되는 경비를 줄이거나, 우량한 배우자를 사용하여 건강한 종묘를 생산, 폐사율을 줄임으로써 생산량을 증가시키는 방법이 있다. 모패의 사육관리에 소요되는 비용 절감과 우량 어미간 선택교배에 의한 우량종묘 생산을 동시에 해결할 수 있는 방법이 정자의 냉동보존 방법이다. 본 연구는 참굴의 정자 냉동보존시 적정 결빙억제제(cryoprotective agent, CPA) 및 농도를 탐색하고자, CPA 종류 및 농도별 냉동보존 효과를 파악하고 해동 후 정자의 세포 손상 등을 조사하였다. 실험에 사용한 참굴의 정액은 참굴 인공종묘배양장에서 모패로 사용 중인 2년생(각장 90.9±2.5 mm, 전중 62.3±3.0 g, 30마리) 어미굴로부터 채취하였다. CPA 종류 및 농도별 냉동효과를 조사하기 위한 희석액으로는 여과해수(33 psu)를, CPA는 dimethyl sulfoxide(DMSO), ethylene glycol (EG), glycerol 및 methanol을 사용하였다. 사용 농도는 전체 희석액에서 CPA의 최종농도가 각각 5, 10, 15, 20%가 되도록 하였다. CPA 및 농도별 냉동/해동 참굴 정자의 세포 손상을 파악하기 위하여 냉동보존 중인 참굴 정자를 해동하여 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)으로 관찰하였다. CPA 종류 및 농도별 냉동보존 참굴 정자의 해동 후 생존율을 측정한 결과, DMSO로 냉동보존 한 참굴 정자의 생존율은 모든 농도에서 50% 이상이었으나, EG로 냉동보존 한 참굴 정자의 생존율은 농도 15%를 제외하고는 50% 이하 이었다. Glycerol과 methanol을 CPA로 사용하여 냉동보존한 참굴 정자 의 생존율은 모든 농도에서 20% 이하로 낮게 나타났다. CPA 종류 및 농도별 냉동보존 참굴정자의 해동 후 운동성을 측정한 결과, DMSO로 냉동보존한 참굴 정자의 SAI는 모든 농도에서 1.5 이상이었으나, 다른 CPA를 사용하여 냉동보존 한 참굴 정자의 SAI는 모두 1.0 이하로 운동성이 낮았다. CPA 종류 및 농도별 냉동/해동 후 참굴 정자의 형태를 SEM으로 관찰한 결과, 모든 종류의 CPA에서 농도가 낮아짐에 따라 정자 두부의 변형과 꼬리의 절단이 발생한 정자의 관찰빈도가 높았다. 냉동/해동 정자의 세포 손상은 DMSO, EG, methanol, glycerol 순으로 적었으며, 농도는 15, 20, 10, 5% 순으로 적었다. 이상의 결과를 종합한 결과, 참굴 정자의 냉동보존 시적정 CPA 및 농도는 15% DMSO이었다.

동물 생명체의 냉동보존 연구는 정자 및 알과 같은 단세포에서 발생배와 같은 다세포 냉동보존기법개발로 이행되어 왔다. 동물 배우자의 냉동보존에 대한 연구는 Polge and Roson (1952)의 가축배우자 냉동보존과 Shemen (1953)의 인간 배우자 냉동보존 시도가 그 효시였다. 한편, 발생배 냉동보존에 관하여는 Whittingham (1971)의 생쥐 발생배 냉동보존 연구가 최초로 이루어진 다음, 2～4세포기에서 포배에 이르기까지 발생배에 대한 냉동보존(Otoi et al., 1995; Carvalho et al., 1996; Dinnyes et al., 1996; Naitana et al., 1996; Im et al., 1997)과 쥐(Shaw et al., 1995), 소(Niemann, 1984; Im et al., 1997)의 발생배에 다양한 냉동률을 적용한 냉동보존 결과가 보고된 바 있다. 그러나 해양생물에 있어 어류나 무척추동물 발생배에 대한 냉동보존 연구는 아직 초기단계로 미미한 실정이다. 특히, 패류발생배의 냉동보존의 연구는 종 다양성이나 연구항목에 있어 부족한 부분이 많다. 더욱이, 참굴과 같은 패류의 양식에서는 발생배의 대량 냉동보존에 의해 연중 종묘생산을 꾀하거나 선발 육종한 굴의 종 보존을 하기 위해 발생배의 냉동보존 기술개발이 절대적으로 필요한 실정이다. 최근 Tiersch (2001)의 버지니아굴에 대한 유생 냉동보존을 위시하여 Choi and Chang (2003)의 진주조개, Pinctada fucata martensii 유생의 냉동보존 연구 등이 있으나, 적정 동해방지제를 찾기 위한 동해방지제 침지실험 등이 이루어지지 않아 체계적으로 연구되었다고 보기 어렵다. 따라서 조개류 발생배의 냉동보존기술을 체계적으로 개발하기 위하여는 발생배의 냉동보존 시 초기발생 단계를 포함한 발생단계별 냉동효과, 침지실험에 의한 동해방지제, 평형시간 구명 및 최종적인 냉동보존 효과 파악을 위한 동해방지제에 따른 활성영향, 적정농도 및 냉동실험이 체계적으로 이루어져야 한다. 본 연구에서는 참굴, Crassostrea gigas 발생배의 최적 냉동보존 조건을 파악하기 위하여 발생배의 동해방지제 침지농도별 활성평가 및 냉동보존 효과를 조사하였다. 2년생 양식산 참굴을 채란용 모패로 사용하였으며, 생식소절개법으로 채란․채정하여 얻은 수정란으로 실험하였다. 동해방지제별, 농도별 침지에 따른 참굴 발생배에 미치는 활성영향을 평가하기 위해, 인공해수(NaCl 2.7 g, KCl 0.07 g, NaHCO3 0.05 g, CaCl2 0.12 g, MgCl2 0.46 g, Milli-Q water 100 ㎖)를 희석액으로 하고, 여기에 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG)를 최종농도가 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 M이 되도록 혼합한 다음, 발생배를 침지하였다. 10분 경과 시 발생배로부터 동해방지제를 깨끗이 제거한 다음, 5분 간격으로 20분 동안 trochophore, D형유생의 생사 여부 및 운동성을 관찰하였다. 이때 광학현미경(×100)의 한시야에서 움직이는 유생을 다음의 유생운동 평가표에 따라 유생활성지수(larval activity index, LAI)를 산정하였으며, 모든 실험은 3반복으로 실시하였다. 동해방지제별, 농도별 침지에 따른 참굴 발생배의 냉동-해동 후 생존율을 평가하기 위해, 전술한 인공해수를 이용하여 만든 0.2 M sucrose 용액을 희석액으로 사용하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG)을 동해방지제로 사용하여 최종농도가 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 M이 되도록 한 다음 실험하였다. 참굴의 trochophore 및 D형유생을 선택하여, 준비한 각 용액에 유생을 실온에서 10분 동안 침지한 후 0.5 ㎖ straw (FHK, Japan)에 넣고, 최초 온도가 0℃로 설정되어 있는 프로그램냉동기(삼원냉열엔지니어링, Korea)에서 냉동속도 －1℃/분으로 －12℃까지 냉각하였다. 이후 －12℃에서 식빙(seeding)한 다음, 다시 냉동속도 －1℃/분으로 또 －35℃까지 냉각하였다. －35℃에 30분 유지한 후, 유생은 즉시 －196℃의 액체질소통(MVE, USA)에 옮겨 보관하였다. 냉동보관 24시간 후 25℃의 담수에서 유생을 급속해동하여 여과해수로 희석한 다음, 광학현미경(×100)에 의해 섬모운동에 의한 유영과 심작박동 여부로 생존율을 조사하였으며, 모든 실험은 3반복으로 실시하였다. 참굴의 발생단계 중 유생의 섬모운동을 시작하는 단계인 trochophore, D형유생을 사용하여 동해 방지제별, 농도별 침지에 따른 발생배에 미치는 활성을 관찰한 결과, 각 유생의 LAI는 모든 동해방지제의 0.1 M 농도에서 높았으며, 농도가 높을수록 LAI가 낮아짐을 알 수 있었다. 동해방지제 침지농도에 따른 유생의 반응은 농도가 낮은 실험구에서 비대칭 나선운동이 멈추었으나, 농도가 높아질수록 섬모운동을 멈추고 움직이지 않는 채로 심장박동만 관찰되었다. Trochophore보다 D형유생을 사용한 실험구에서 전체적으로 LAI가 높아 D형유생을 사용한 실험구가 trochophore 실험구보다 동해방지제에 대한 내성이 강한 것으로 나타났다. 각각의 동해방지제 중에서 EG에 침지한 유생의 LAI가 다른 동해방지제보다 유의하게 높아, EG이 참굴 발생배의 냉동실험에 가장 적합하였다. 동해방지제별, 농도별 희석액 0.2 M에서 참굴 trochophore 및 D형유생의 냉동-해동후 생존율은 2.0 M EG에서 가장 높았으며, 유생의 생존율은 각각 63.0±12.3%, 88.8±4.3%였다.

인공 종묘생산 과정의 첫째 조건은 양질의 수정란을 확보하는 것이며, 산란유발은 생산성을 높이는데 필요한 선결과제이다. 그러므로 성숙한 어미로부터 일시에 대량의 수정란을 얻기 위한 여러 가지 방법들이 시도되고 있다. 따라서 본 연구는 가장 중요한 패류양식 종인 참굴, Crassostrea gigas를 대상으로 자극방법별 산란유발 효과를 조사하였다. 실험용 참굴은 산란기 (6～7월)에 각장 58.2～73.1 ㎜, 전중 87.5～93.2 g의 2년산 모패를 사용하였다. 참굴은 채집 즉시 실내수조에 수용하여 20～25℃의 신선한 여과해수를 흘려주면서 24시간 이상 안정시킨 다음, 2ℓ유리 비커에 각각 1개체씩 수용하여 수온상승, 공기노출, H2O2 침지, NH4OH 침지, serotonin 주사, dopamine 주사 등 자극을 주었다. 수온상승 자극에서는 20℃에 수용한 모패를 각각 2℃, 4℃, 6℃ 및 8℃씩 상승시켜 1시간 동안 자극하였고, 공기노출 자극에서는 기온 25℃에서 각각 1 h, 2 h, 3 h 및 4 h씩 노출시켜 자극하였다. H2O2와 NH4OH 침지에서는 각각 5×10－3 M, 1×10－3 M, 5×10－4 M 및 1×10－4 M의 농도로 처리하였다. 또한, 신경전달물질인 serotonin과 dopamine을 10－5, 10－4, 10－3 및 10－2 M 농도로 각 개체의 생식소에 0.2 ㎖ 씩 주사하였으며, 대조구에서는 같은 양의 멸균해수를 주사하였다. 유발효과는 자극방법에 따른 반응률과 자극 후 반응개시 시간을 조사하였으며, 그리고 동일한 처리로 얻어진 알과 정자를 인공수정하여 수정률과 부화율을 조사하였다. 참굴에 대한 산란유발 자극의 반응률은 암컷에서는 serotonin이 81.3±23.9%로 가장 높았으며, 다음으로 수온상승 80.4±24.3%, 공기노출 73.9±23.0%, H2O2 48.8±23.9%, dopamine 41.2±13.9%, NH4OH 28.6±25.4% 순이었다. 한편, 수컷에서는 수온상승이 93.8±12.5%로 가장 높았으며, serotonin 91.7±16.7%, 공기노출 90.8±10.7%, H2O2 57.5±28.7%, NH4OH 47.6±21.7%, dopamine 47.5±14.5%의 순으로 효과적이었다. 전반적으로 볼 때, 수컷이 암컷보다 민감하게 반응하는 경향을 띠었다. 반응까지의 소요시간은 암컷에서 serotonin 12.5±15.1분, dopamine 59.0±9.9분, 수온상승 105.5± 28.3분, 공기노출 129.5±37.9분, H2O2 160.0±23.6분, NH4OH 166.0±24.2분이었다. 수컷에서는 serotonin 7.5±7.0분, 수온상승 31.5±11.5분, dopamine 34.3±4.5분, 공기노출 46.0±17.5분, NH4OH 52.8±19.7분, H2O2 109.8±12.1분이었으며, 각 실험구에서 수컷이 암컷보다 빠르게 반응하였다. 수정률에서 NH4OH 88.9±1.9%, H2O2 95.6±1.9%, dopamine 96.7±3.3%였으며, 공기노출, 수온상승 및 serotonin은 100%의 높은 수정률을 보였다. 부화율에서 NH4OH 80.0±3.3%, 공기노출 85.6±5.1%, H2O2 92.2±1.9%, dopamine 94.4±3.8%, 수온상승 95.6±1.9%, serotonin 100% 순으로 높은 부화율을 보였다.