국내외적으로 기후변화, 이상기상 등 다양한 요인이 新문제 병해충의 발생을 가속화하고 있으나, 반대로 국제 기구에서 2030년까지 화학농약의 사용 및 위해도를 50%로 낮출 것을 요구하고 있다(생물다양성협약 COP15. 2022.12). 따라서 화학농약을 줄이면서 효과적으로 병해충을 방제할 수 있는 대안을 찾아야 한다. 화학농약의 대안으로 생명과학에 공학적 기술개념을 도입하여 인공적으로 생명체의 구성요소·시스템을 설 계·제작·합성하는 학문분야로 합성생물학이 주목받고 있다. 코로나19 백신개발과정에 합성생물학을 활용하여 개발기간을 단축한 사례(mRNA 백신)도 있다. 미국 농업분야에서는 dsRNA를 이용한 천연식물보호제(생물농 약)의 개발은 이미 상용화 단계로 넘어서고 있다. 이에 우리나라도 합성생물학을 활용한 농약의 개발과 상용화를 지원할 수 있는 제도적 기반을 마련할 시점이다. 본 발표에서는 합성생물학 기술을 이용한 新천연식물보호제의 개발과 상용화에 필요한 등록기준 마련 필요성과 고려할 사항에 대해 다각적으로 논의하고자 한다. 현재 우리나라에서 농약은 「농약관리법」에 따라 관리되며, 유효성분으로 쓰이는 원료의 종류에 따라 화학 농약과 천연식물보호제로 구분되고 있다. 화학농약은 “화학적으로 합성한 유효성분으로 제조한 것”을 말하며, 천연식물보호제는 “살아있는 미생물 또는 자연계에서 생성된 유기화합물 및 무기화합물”을 유효성분으로 제조 한 것“을 말한다. dsRNA 농약 등록을 위해서는 dsRNA 등 합성생물학 기술을 이용한 농약이 “자연계에서 생성된 유기화학물”로 분류될 수 있는 지에 대한 검토가 필요하며, dsRNA를 활용한 농약의 등록 기준이 마련되어야 한다. 기준을 마련하기 위해서는 합성생물학 기술에 대한 정확한 이해가 선행되어야 하고, 안전성에 대한 다각적 인 검토는 물론, 사회적 합의와 공감대 형성이 이루어져야 할 것이다. 우선 가장 중요한 이슈는 역시 유전자변형생물체(이하 ”LMO“) 문제이다. 국내에서는 LMO 작물의 재배 자체 에 대한 논란이 많은 상황이라는 점과 LMO일 경우 농약으로 등록시 기준 적용에 차이가 크기 때문이다. 천연식물 보호제는 화학농약보다는 등록시 요구되는 자료가 많이 간소화되어 있지만, LMO에 해당되면 그렇지 않다. 실제 미국에서 등록된 dsRNA 농약에는 LMO에 해당되는 것과 해당되지 않는 것이 있다. 따라서 국내에서 천연식물보 호제로 등록하기 위해서는 먼저 dsRNA를 활용한 기술이 LMO에 해당되는 지 여부가 먼저 정립되어야 하고, 해당 dsRNA 원제(Technical) 또는 해당 dsRNA 제품(Item)이 LMO 기술이 적용되지 않았음을 입증할 수 있는 체계 의 정립이 필요할 것이다. 또한 국제기준과 조화의 문제를 고려해야 한다. OECD 발간 문서(ENV/CBC/MONO(2023)26, ENV/JM/MONO (2020)26)에 따르면 dsRNA 농약은 dsRNA의 변이가 인체, 환경은 물론, 표적/비표적 유기체에 어떠한 영향을 미칠수 있는지에 대한 시험이 필요하고 이는 각 국가별 규제요건에 따라 달라질 수 있다고 밝히고 있다. 국내 기준을 마련하기 위해서는 외국 사례를 정밀하게 조사분석한 후 국내 여건에 맞도록 기준을 정립해야 할 것이다. 마지막으로 새로운 기술은 항상 부작용에 대한 우려가 따르기 마련이므로 전문가에 의해 과학적 근거에 기반 한 기준안이 마련함은 물론, 해당 기준안에 대한 대국민 소통/공감을 형성하는 과정도 필요하다. dsRNA농약은 우리나라에 새로운 도전이자 기회가 일 수 있다. 농약원제 개발에 뒤처져 수입에 의존하는 산업 에서 벗어나, 세계를 선도하며 수출하는 농약산업으로 바꿔야 할 시점인 것 같다.

Since the gene expression interference induced by dsRNA was discovered, dsRNA has been considered as an antiviral agent and pesticide to protect beneficial insects and crops, respectively. Recently, dsRNA was classified as IRAC mode of action group 35, and the first dsRNA pesticide, Calatha of GreenLight Bioscience, has been approved by EPA. Also an animal drug for Asian honeybee, HoneyGuard-R of Genolution is about to be approved by APQA. During the last two decades, hundreds of papers already had demonstrated the application and capability of dsRNA for agriculture, however, we have just a few commercialized products at hand at this moment. It is time to understand the processes, hurdles and limitations on the industry side that are indispensable for the development, registration and commercialization of dsRNA-based products.

RNAi (RNA interference, RNA 간섭)은 타겟 유전자의 mRNA 시퀀스와 상동한 이중 가닥 RNA (double-stranded RNA)에 의해 일어난다는 사실이 밝혀진 이후, 유전자의 기능을 파악하는 연구 도구로 활용되다가, 2018년에 비로소 사람의 유전자 치료제로 상용화가 되었다. 지금은 더 많은 질병들의 유전자 치료제를 만들기 위해 다양한 회사들이 임상을 진행하고 있다. 농업의 분야에서는 곤충의 ‘생존 필수 유전자’를 타겟함으로써 해충 방제제로 개발되어 서부 옥수수 뿌리벌레(Western corn rootworm)를 RNAi로 방제하기 위한 제품이 종자 형식으로 상용화 되었고, 최근에는 심각한 농약저항성을 가진 콜로라도 감자벌레(Colorado potato beetle)를 RNAi로 방제하기 위 해 ‘스프레이 방식의 뿌리는 dsRNA’가 상용화되었다. 추후에 더 많은 해충을 타겟으로 하는 제품이 개발될 예정 이다. 본 발표에서는 위에 언급한 상용화된 dsRNA 시퀀스의 환경안전성평가와 관련된 연구, off-target effect, siRNA 활용, nanoparticle 등 RNAi 기술을 보다 안전하고 유용하게 농업적으로 사용할 수 있는 방법에 대한 ‘실험 실의 역할’이 무엇인지 알아보고자 한다.

과거 약 50년간 국내에서는 화학농약 기반의 병해충 방제가 지속적으로 농업 생산량을 안정적으로 유지시켜 왔다. 그러나 무분별한 화학 농약 사용은 병해충의 약제저항성 발달을 유발하였으며, 이는 기존의 방제효과를 얻기 위해 고농도 살포가 불가피하였으며, 또한 막대한 개발 비용이 필요한 신규 작용점 살충제 개발로 고비용의 방제기술로 전락하게 되었다. 여기에 대부분의 살충제가 신경계에 작용하여 인축 및 비표적 생물계에 영향을 주어 광범위한 사용에 제한을 받게 되었다. 대체 방제기술로 천적과 미생물에 의존하는 생물농약은 방제효율에 서 대부분 화학약제의 수준을 따르지 못해 농민의 절대적 호응을 받지 못하였다. 이 가운데 새로운 패러다임의 생물농약으로 살포용 dsRNA 농약이 화학농약의 방제 효과와 버금가는 시험 농가 반응으로 2023년 12월에 미국 EPA 등록을 받게 되었다. 향후 살포용 dsRNA는 살충제는 물론이고 살균제 및 제초제에 이르기까지 작물보호제 시장 전체에 영향을 미치게 된다. 이에 국내에서도 dsRNA를 실험실 단계에서 산업계 적용 기술 개발 단계로 전환하여야 할 시점에 이르게 되었다.

RNA interference (RNAi) has been applied to control insect pests using gene silencing machinery in which small interfering RNA derived from dsRNA specifically degrades target mRNA. This study optimized dsRNA insecticide specific to thrips infecting hot peppers. Among potent candidate target genes, vATPase B was chosen because its RNAi was highly efficient as much as Snf7, a well-known RNAi target gene. Although RNAi specific vATPase B is lethal to Frankliniella occidentalis, it was not much effective to control other thrips species such as F. intonsa and Thrips tabaci. To expand its target spectrum, we devised a mixture treatment of dsRNA specific to individual species. As expected, each dsRNA was highly efficient in a species-specific manner. This supported the hypothesis of 21mer identity for the efficient RNAi. However, the dsRNA mixture efficiently killed the three thrips species in a crop field. To further expand its spectrum to the whitefly, Bemisia tabaci, we applied virus-induced gene silencing (VIGS) to produce dsRNA in the hot peppers using Tobacco Rattle Virus. VIGS successfully suppressed control gene. dsRNA produced by VIGS gave significnat mortality to B. tabaci in addition to the thrips. These results suggest a technique to expand dsRNA insecticide spectrum using a mixture treatment and VIGS in insect pest control_.

전 세계적으로 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)을 활용한 해충방제제 연구가 활발히 진행되고 있다. 대표적 으로 Monsanto의 서부 옥수수 뿌리벌레(Diabrotica virgifera virgifera) 특이적 방제용 dsRNA (DvSNF7)를 발현하 는 옥수수 종자가 상용화 되었고, 2016년 이 종자가 국내 사료 및 식품용으로 수입이 승인 되었다. 본 연구는 국내 에 서식하는 좁은가슴잎벌레(Phaedon brassicae)를 Non-target 곤충으로 사용하여, 옥수수 종자에 사용된 DvSNF7 dsRNA의 잠재적 위해성을 평가했다. P. brassicae의 SNF7 유전자와 DvSNF7 dsRNA 간 Sequence유사성 을 확인했다. 다음으로 P. brassicae가 DvSNF7 dsRNA를 섭식할 수 있는 환경을 조성하여, 치사 효과 실험과 Sequence특이적인 Knockdown효과를 확인하였다. 그 결과, DvSNF7 dsRNA는 P. brassicae생존에 영향을 미치지 않았으며, P. brassicae의 SNF7유전자를 Knockdown시키지 않음을 확인했다. 이번 연구를 통해 D. virgifera virgifera와 같은 과인 P. brassicae 는 SNF7유전자 간 Sequence유사성이 있지만, Sequence특이성이 부족하여 생존과 유전자 발현에 영향을 주지 않음으로써 위해성이 낮음을 확인했다.

GN01 is a new antiviral medicine acting against Korean Sacbrood virus (KSBV) of honeybees. It contains 5 mg/mL of active ingredient, double stranded RNAs(dsRNA), that homologous to KSBV ribonucleic acid coding coat protein (VP1) of virus and inducing RNA interference (RNAi). RNA medicine is generally recognized as safe for rapid breakage by intrinsic ribonuclease and limited absorption from gastrointestinal tract. However, there were no data of repeat-dose toxicity in laboratory animals for dsRNA targeting SBV. This study was performed to investigate toxicity of GN01 in SD rats after weekly oral dosing for 28 days and to determine its no-observed-adverse-effect-level (NOAEL). Male and female SD rats were orally administered with GN01 at 0, 25, 50 and 100 mg/kg bw/day of dsRNA once per week for 28 days (total 5 administrations). The highest dose 100 mg/kg bw/day was determined based on the maximum volume injectable (20 mL/kg bw) via gavage. During treatment period, clinical signs, functional and sensory responses, body weights, food and water consumption, ophthalmological findings and urinalysis were investigated. After treatment period, hematological and clinical biochemistry tests and examination of necropsy findings, organ weights and histopathological lesions were performed. There were no significant differences between all test groups and vehicle control group in all measured parameters. Therefore, the NOAEL of GN01 was determined 100 mg/kg bw/day, the highest dose administered. In conclusion, repeated oral administration of GN01, a dsRNA medicinal product, is safe even at the maximum available dose in rats.

The ectoparasitic mite, Varroa destructor is one of the most destructive pests of the honeybee (Apis mellifera) leading to the collapse honey bee colony in many regions of the world. RNA interference (RNAi) is a novel approach recently proposed for insect pest control. However, the efficiency of RNAi in insects is low due to the lack of effective delivery methods for dsRNA and sensitivity to nuclease degradation. Therefore, the success of RNAi technology largely depends on the stability of dsRNA. To explore the possibility of using RNAi to control varroa mite, we determined the effects of dsRNA targeting a subunit of the cytoplasmic coatomer protein complex B2, D, and E subunits on target gene expression for varroa mite. We observe that dsRNA ingested by bees is transferred to the varroa mite, resulting in knockdown of COPB2 expression. Furthermore, we demonstrate that chitosan nanoparticles-dsRNA complexes were more stable for 7 days in honeybee tissue fluids. The dsRNA-conjugated with chitosan was protected from degradation in hemolymph, fat body, and midgut extracts collected from the honeybee. These results possibly suggest that nanoparticles-dsRNA complexes might be horizontally transferred from treated honeybee to varroa mite, in which case the honeybees could serve as RNAi vectors. We confirmed, moreover, dsRNA fed nontarget insects, honeybee, were unaffected, and no toxicity was observed for honeybee. Overall, these data suggest that dsRNA-conjugated with chitosan help escape effectively from degradation by honeybee tissue fluids and could improve RNAi efficiency in varroa mite.

The western flower thrips, Frankliniella occidentalis, is a significant economic pest among thysanopterans because of its massive feeding damage and ability to spread tospovirus to hundreds of plant species worldwide. To control this pest, chemical insecticides have been used but become unsatisfactory in the control efficacy due to the rapid resistance development of F. occidentalis. The cost-effective chitosan-based nanoparticle (NP) formulations as dsRNA insecticide gave > 80% mortalities in 7 days in the field condition. Nevertheless, the usage of NP-based dsRNA is hindered by the conflict between the excessive expense of producing dsRNA and the massive quantity of materials required for field application. Many research reports have demonstrated microbial-based dsRNA production using the L4440 vector and HT115 (DE3) Escherichia coli for application to vertebrate and invertebrate systems. In this study, we aimed to compare chitosan NP and bacterial formulation-based dsRNA control tactics against F. occidentalis using RNAi against the vacuolartype ATPase (vATPase) gene.

지난 10년 동안, 이중 가닥 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)를 이용한 특정 유전자 발현 간섭(RNA interference, RNAi) 기술은 의약품 개발뿐만 아니라 작물보호 분야에 해충방제부터 익충보호까지 다양하게 그 기술이 사용되어 왔다. 그동안 학계 및 산업체에서 활발히 연 구되어 온 RNAi기술을 이용한 작물 및 익충보호제는 상용화를 눈앞에 두고 있다. 미래 농업 시장에서 해충방제제와 익충보호제로써의 개발을 위한 RNAi의 기술적 응용은 상당한 잠재력을 가지고 있지만, 현장에 직접 사용되기에는 아직 여러 가지 한계점이나 극복해야 할 과제가 남아있 다. 본 리뷰에서는 최근에 활발히 진행되고 있는 작물보호제 및 익충보호제(protection of crops and beneficial insects)로써의 dsRNA의 다양 한 활용과 그 잠재성(potential)을 소개하고자 한다.

The Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer is widely used to generate genetic transformation of plants and transient assay of temporal exogenous gene expression. Syringe infiltration system into tobacco (Nicotiana benthamiana) leaves is a powerful tool for transient expression of target protein to study protein localization, protein-protein binding and protein production. However, the protocol and technical information of transient gene expression, especially double strand RNA (dsRNA), in tobacco using Agrobacterium is not well known. Recently, dsRNA is crucial for insecticidal effect on destructive agronomic pest such as Corn rootworm. In this study, we investigated the factor influencing the dsRNA expression efficiency of syringe agro-infiltration in tobacco. To search the best combination for dsRNA transient expression in tobacco, applied two Agrobacterium cell lines and three plant vector systems. The efficiency of dsRNA expression has estimated by real-time PCR and digital PCR. As a result, pHellsgate12 vector constructs showed the most effective accumulation of dsRNA in the cell. These results indicated that the efficiency of dsRNA expression was depending on the kind of vector rather than Agrobacterium cells. In summary, the optimized combination of transient dsRNA expression system in tobacco might be useful to in vivo dsRNA expression for functional study and risk assessment of dsRNA.

Honeybees are inevitably threatened by various pathogens including Sacbrood virus (SBV) and Galleria mellonella. Recently, RNA interference (RNAi) has been suggested as a promising strategy for suppression of honey bee viruses. Also, Bacillus thuringiensis (Bt) has been widely applied for the control of lepidopteran pests such as G. mellonella. In this study, it was intended to develop dsRNA production platform using Bt. For this, the pHT1K-SBV vp1 vector which transcribes sense and anti-sense SBV vp1 gene under control of Cyt1Aa sporulation-dependent promoter was introduced into Bt strain NT0423 expressing Cry1-types toxins. SBV replication was suppressed in the worker A. cerana ingested dsRNA produced from the Bt transformant. Crystal proteins from the Bt transformant showed high level of insecticidal activity against 4th instar larvae of G. mellonella.

A species of Beauveria bassiana is widely used for biological pest management in many countries. Many efforts have been given to figure out the clear fungal mode of action to enhance the insecticidal activity. Homologous recombination (knock-out) or hairpin RNA (knock-down) is popularly used in fungal gene function study, but gene cloning and generation of knock-out or -down mutants takes long time or temporarily knock-downed. Here in this work, we used previously generated egfp-expressing B. bassiana strain (Bb-egfp #3) and integrated dsegfp to the Bb-egfp #3 using a protoplast integration method. This work suggests that protoplast integration with dsRNA possibly generate significantly reduced gene expression in B. bassiana and the reduction is quite stable over generations which provide easy of functional study for fungal mode of action.

Frankliniella occidentalis is a major pest in agriculture. Following overuse of insecticides, high resistance has developed due to its high reproduction rate and short generation time. To control the resistant strains of the thrips, the ingestion RNAi- based control was established. A total of 67 genes were selected, and their double-stranded RNAs (dsRNA) were delivered to thrips via the leaf disc-feeding method. Among the genes screened, the dsRNA of Toll-like receptor 6 (TLR6) and coatomer protein subunit epsilon (COPE) resulted in the highest mortality (3.8- and 2.8-fold faster LT50 compared to control, respectively) when ingested by thrips. The dsRNA-fed thrips showed 53% and 83% reduced transcription levels of TLR6 and COPE, respectively. This result demonstrates that the observed mortality of thrips following dsRNA ingestion was due to RNAi, and this lethal genes can be employed as a practical tool to control thrips in the field.

RNA interference (RNAi) has been considered as an alternative strategy to control agricultural pest whereby double-stranded RNA triggers a potent and specific inhibition of its homologous mRNA. Since small dsRNAs are required for various RNAi applications, there is a need for cost-effective methods for producing large quantities of high-quality dsRNA. In this study, Bacillus thuringiensis (Bt) based dsRNA production platform was established under control of sporulation-dependent promoter and vp1 gene of Sacbrood virus (SBV) was introduced. The dsRNA against vp1 gene produced from the Bt suppressed the replication of SBV. In addition, the dsRNA was assembled into inulin coated-nanoparticle to increase stability of dsRNA in environment.