Bacillus thuringiensis(B.t.)에서 cry gene은 plasmid DNA상에 존재하고 대상 곤충에 살충활성을 나타내는 내독소단백질 형성에 관여하는 주요 유전자이다.파밤나방(spodoptera exigua)에 높은 살충활성을 보이는 B.t. subsp. aizawai KB098 균주의 cry gene이 위치하는 plasmid DNA를 찾기 위해 curing 방법을 사용하였다. KB098균주는 cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D 4개의 cry gene을 가지고 있으며, Plasmid DNA는 7개가 확인되었다. Cry gene을 암호화하는 plasmid DNA를 찾기 위한 curing 방법은 LB배지에 KB098균주를 희석 후, 27℃ 진탕배양기에서 24시간 배양한 뒤 NA배지에 spreading 한 후, 42℃조건으로 48시간 배양하여 단일 colony를 얻었다. 위상차현미경으로 관찰했을 때 내독소단백질을 형성하지 않는 colony를 NA배지에 streaking하여 27℃ 조건으로 4일간 배양하였다. 위상차현미경관찰을 통해 내독소단백질을 형성하지 않는 colony를 선발하였다. Curing과정이 제대로 수행되었는지 확인하기 위해 SDS-PAGE를 통하여 분자량 130kDa의 내독소단백질 band가 형성되지 않음을 확인하였으며, PCR증폭을 통해 acrystalliferous균주가 KB098 균주가 가지고 있는 4개의 cry gene을 가지고 있지 않음을 확인하였다. cry gene을 암호화 하는 plasmid DNA를 찾기 위해 KB098균주와 5개의 acrystalliferous균주와의 plasmid DNA pattern을 비교하였다. acrystalliferous균주에서 결실된 plasmid DNA만을 gel elution 한 후에 PCR을 통해 cry gene의 존재를 확인하였다.

Tannic acid가 파밤나방의 중장액에 존재하는 단백질분해효소의 활성을 저해함으로 처리된 Bacillus thuringiensis(이하 B. thuringiensis) subsp. kurstaki KB100균주의 insecticidal crystal proteins(ICPs)의 과분해를 억제하며 살충활성을 상승시키는 효과가 있다는 연구결과를 기초로, tannic acid의 protease inhibition여부 및 tannic acid가 B. thuringiensis KB100균주의 parasporal inclusion에 미치는 영향을 조사하였다. Tannic acid와 파밤나방 중장액을 먼저 혼합하여 반응시킨 후 B. thuringiensis KB100의 parasporal inclusion에 처리하여 SDS-PAGE를 통해 단백질밴드를 확인한 결과, 중장액내의 단백질분해효소에 의해 정상적으로 분해되어 60KDa의 살충활성을 나타내는 독소단백질 밴드를 나타냈다. 따라서 tannic acid에 의한 살충활성증대의 정확한 영향을 확인하기 위해, B. thuringiensis의 parasporal inclusion과 먼저 혼합하여 반응시킨 후 파밤나방 중장액을 처리하고 단백질 밴드패턴을 확인한 결과 전독소인 130kDa의 단백질이 거의 분해되지 않고 나타났다. B. thuringiensis KB100의 parasporal inclusion과 tannic acid을 먼저 혼합하여 반응시킨 것을 위상차현미경하에서 확인한 결과, tannic acid의 농도가 높아질수록 parasporal inclusion이 응집하여 있는 것이 확인되어, tannic acid가 파밤나방 중장 내 소화효소에 반응하는 영향보다 B. thuringiensis 독소단백질의 응집을 통해 소화효소의 분해저해 원인 가능성을 확인하였다.

곤충의 장내 공생미생물은 소화, 발육, 생존, 번식 및 필수성분의 합성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 이러한 공생미생물은 모세대로부터 얻어지는 수직적 전달과, 자연환경이나 먹이와 같은 외부적 요인으로부터 얻어지는 수평적 전달을 통해 획득되는 것으로 확인되고 있다. 본 연구에서는 콩과작물에 주요해충인 톱다리개미허리노린재(Riptortus pedestris)의 장내공생자이며, 수평적 전달을 통해서 획득되는 것으로 알려진 Burkholderia spp.와 이외의 장내세균이 톱다리개미허리노린재의 생물적ㆍ생태학적 특성에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 톱다리개미허리노린재 야외개체군과 실내 누대사육 개체군의 성충 소화기관을 채취하고 TSA배지에 배양하여 장내세균을 분리동정한 결과, 야외개체군에서만 Burkholderia spp. 균주를 확인 할 수 있었다. 실내사육개체의 누대사육과정에서 실제로 발생하는 발달이나 생식의 저해가 Burkholderia spp. 장내세균의 부재로 인한 것인지 확인하는 과정이 필요했다. 톱다리개미허리노린재의 장내세균 억제를 위한 항생제를 선발하고, 외부로부터 Burkholdria spp.가 유입될 가능성이 있는 기주와 토양(상토), 콩종자를 (Yoshitomo et al., 2011) 사용한 방법을 인용하여 모두 멸균 및 소독하여 부재시키고, Burkholderia spp. 균주도 같은 방법으로 처리하여 사육하였으며, 처리구별 충체길이를 측정하여 발육정도를 비교하였다. Burkhodria spp.를 모두 제거한 개체군과 제거하고 이 균주를 처리하여 획득하게 한 개체군, 정상개체군간의 발육의 정도에 있어 차이를 보이는 것으로 확인되었으며, 추후 약충기간, 성비, 생식정도를 확인하여 공생세균인 Burkhodria spp.가 톱다리개미허리노린재에 미치는 영향을 확인해야 할 것으로 판단되며, 그 외의 분리동정된 균주의 장내세균으로서의 가능성 또한 확인할 계획이다.

곤충은 먹이에 따라 장내세균에 차이를 보이고, 장내세균은 필수 아미노산이나 비타민을 만들어 기주의 발육과 생장, 생식등 생리 생태에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 본 연구에서는 포식성 무당벌레 (Harmonia axyridis)의 령기별, 먹이별로 장내에 존재하고 있는 세균의 분리 및 동정을 통해, 무당벌레 장내미생물의 종류를 알아보고 식식성인 28점박이무당벌레(Henosepilachna vigintioctomaculata)의 장내 미생물과의 비교를 통하여 기주곤충의 생태학적, 생물학적 특성에 영향을 미치는 장내세균의 선발 및 새로운 생물소재로의 가능성을 검토하고자 하였다. 포식성 무당벌레(H. axyridis)는 무테두리진딧물을 먹이로 공급하여 실내에서 누대사육을 통해 확보한 자손세대 무당벌레 유충과 성충의 소화기관을 분리하고 장내세균을 분리 동정한 결과, Staphylococcus saprophycus, S. sciuri를 포함한 총 31균주가 분리 동정되었다. 28점박이무당벌레 (H. vigintioctomaculata)는 토마토잎을 먹이로 공급하여 누대사육하한 유충과 성충의 소화기관을 분리하여 분리 동정한 결과, Pseudomonas viridiflava를 포함한 총 6균주가 분리 동정되었다. 예상과는 다르게, 포식성 무당벌레와 식식성 무당벌레의 장내 세균사이에 공통된 세균은 존재하지 않았으며, 식식성 무당벌레의 장내세균 종이 현저히 적은 것도 확인할 수 있었다. 포식성 무당벌레의 유충 전 령기와 성충에서 존재한 S. saprophycus의 경우 무당벌레의 생장과 생식에 영향을 주었다. 동일하게 S. sciuri도 유충과 성충의 전 령기에 존재하였고, S. saprophycus와는 다르게 단백질 분해능력이 있음을 확인하여 실험균주로 선발하여 항생제와 실험균주를 먹이에 처리하여 S. sciuri의 존재여부에 따른 기주곤충의 발육특성 및 생식특성에 미치는 영향을 조사하였다.

cry gene은 Bacillus thuringienesis(B.t.)에서 대상 곤충에 살충활성을 나타내는 내독소단백질을 형성하는 주요 유전자로 특정 plasmid DNA상에 암호화되어 있 다. B.t. subsp. aizawai KB098 균주는 파밤나방(spodoptera exigua)에 높은 살충 활성을 보이는 균주로 본 연구에서는 이 균주의 cry gene이 위치하는 plasmid DNA를 찾고자 하였다. 본 실험에 이용된 KB098균주는 cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D 4개의 cry gene을 가지고 있으며, Plasmid DNA는 7개가 확인되었다. Cry gene을 암호화하는 plasmid DNA를 찾기 위해 acrystalliferous균주가 필요하였으 며, 42℃조건으로 48시간 열처리 후 새로운 배지에 27℃ 조건으로 3일간 재배양 하여 sporulation단계에서 위상차현미경관찰을 통해 내독소단백질을 형성하지 않 는 colony를 autolysis 단계까지 배양한 후에 위상차현미경으로 재확인하여 확보 할 수 있었다. 획득한 14개의 acrystalliferous를 균주 중, 서로 다른 pattern의 plasmid DNA를 갖는 5개의 균주를 선발하였고, acrystalliferous재확인을 하기 위 해 SDS-PAGE를 통하여 내독소단백질의 분자량인 130kDa의 band가 형성되지 않음을 확인하였으며, PCR증폭을 통해 acrystalliferous균주가 KB098 균주가 가 지고 있는 4개의 cry gene을 가지고 있지 않음을 확인하였다. cry gene을 암호화 하는 plasmid DNA를 찾기 위해 KB098균주와 선발한 5개의 균주와의 plasmid DNA pattern을 비교한 결과, 두 개의 plasmid DNA band에서의 차이가 확인되 었다.

곤충의 생태학적 역할에 있어서 공생미생물은 대부분의 곤충그룹에서 나타나 는 상호간 절대적 이익관계에서부터 해로운 기생적 관계까지 여러 다양성을 가지 고 있다. 곤충의 장내에서나 표면에서 많은 다른 미생물들과 서로 다양한 방법으 로 공존하면서 생활하고 있는데, 넓은 범위에서 공생관계가 있는가 하면 기주의 생리에 아주 밀접하면서 필수적인 관계만을 나타내는 것도 있다. 공생자는 대부분 곤충의 소화기관 부근에서 발견되어지고, 이것은 생장과 발육에 필수적인 아미노 산이나 비타민 등을 합성하는 것으로 밝혀지고 있다. 본 연구에서는 포식성 곤충 인 무당벌레(Harmonia axyridis)의 령기별, 먹이별로 장내에 존재하고 있는 세균 의 분리 및 동정을 통해, 무당벌레 장내미생물의 종류를 알아보고 무당벌레의 생 물학적 특성에 미치는 영향을 보고자하였다. 충남 금산의 월동개체군을 채집하여 무테두리진딧물로 실내에서 누대사육을 통해 확보한 자손세대 무당벌레 유충(1령~4령)과 진딧물, 설탕물, 닭간을 먹인 성 충의 소화기관을 분리하고 장내세균을 분리 동정한 결과, 총 31균주가 분리 동정 되었다. 설탕물을 먹인 성충을 제외하고 모든 령기와 성충에서 Staphylococcus saprophyticus가 분리 동정되어, 이 세균을 실험균주로 선발하여 S. saprophyticus 의 존재여부에 따른 기주곤충의 발육특성 및 생식특성에 미치는 영향을 조사하였 다. 대상균주의 부재로 인한 특성을 확인하기 위해 항생제인 ofloxacin을 처리한 처리구와, S. saprophyticus을 먹이인 진딧물에 처리하여 공급한 후, 무당벌레의 산란력, 부화율, 번데기 무게, 유충발육기간을 조사한 결과, 알의 부화율은 항생제 처리로 인한 실험 장내세균의 부재로 인해 감소하는 경향을 보였으나, 유충의 발 육기간이나 번데기 무게와 같은 발육특성에 미치는 영향은 확인되지 않았다.

해충에 대한 화학농약의 오남용으로 인하여 해충의 저항성이 발달되고 환경오염, 인축에 대한 위험 등의 이유로 화학농약의 사용을 줄이게 되었다. 그래서 친환경적인 방제인자인 미생물농약 Bacillus thuringiensis(이하 B.t)가 현재 전 세계적으로 널리 사용되고 있다. B.t는 그람 양성의 호기성 간균으로 토양, 곡물의 분진, 낙엽, 곤충의 사체 등 다양한 곳에서 분리되는 것으로 알려져 있는데, 본 연구에서는 풍뎅이류 곤충의 사체로부터 분리한 B.t subsp. kurstaki CAB530 균주가 나비목 해충에 대해서 살충활성을 나타내는 것을 확인하였으며, 특히 난방제 해충인 파밤나방에 살충활성이 뛰어난 KB099 균주와 비교하기 위하여 SDS-PAGE와 PCR을 수행하였다. 파밤나방에 대한 생물활성 검정 결과, CAB530 균주는 처리 48시간 후에 90%가 넘는 사충률을 보여주었며, 다른 B.t subsp. kurstaki SDS-PAGE 수행 결과 파밤나방에 살충활성이 있는 B.t subsp. kurstaki와 비슷한 130kDa의 밴드를 나타내었다. 또한 파밤나방 중장액으로 소화를 시킨 후에 약 65kDa의 활성독소를 확인할 수 있었다. 파밤나방에 6%의 사충율을 보이며 낮은 살충활성을 보인 CAB533 균주는 65kDa의 독소단백질 밴드를 나타냈지만 파밤나방에 대해서 살충활성이 높지는 않았다. PCR수행 결과 파밤나방에 대해서 가장 활성이 높은 CAB530 균주는 Cry1Aa, 1Ab, 1Ac, 1B, 1D, 1E, 1F, 1I, Cry2 유전자가 존재하는 것으로 밝혀졌다.

Among 18 Bacillus thuringiensis isolates with spherical parasporal inclusion from soils, B. thuringiensis subsp. israelensis CAB199 was selected. It was showing over 90% mortality against Aedes aegypti and Culex pipiens moletus. It was confirmed that this B. thuringiensis subsp. israelensis CAB199 isolate also had a insecticidal activity against Culex inatomii that was occurred in the marsh. Because most of mosquito larva were primarily situated or shifted from under- to surface water, we need to select long floating formulations on surface water for controlling mosquito larva. It was tested the pesticidal and control effects in the laboratory and wetland with two formulation types of B. thuringiensis subsp. israelensis, for example, wettable power (WP) and suspension concentrate type (SC). Laboratory test showed that SC formulation type was relatively faster and more effective against 3 tested mosquito species, C. pipiens, Aedes aegypti, and C. inatomii. Otherwise, the control efficacy of SC formulation type was more rapidly appeared against C. inatomii in the wetland.

해충에 대한 화학농약의 오남용으로 인하여 해충의 저항성이 발달되고 환경오염, 인축에 대한 위험 등의 이유로 화학농약의 사용을 줄이게 되었다. 그래서 친환경적인 방제인자인 미생물농약 Bacillus thuringiensis(이하 B.t)가 현재 전 세계적으로 널리 사용되고 있다. B.t는 그람 양성의 호기성 간균으로 토양, 곡물의 분진, 낙엽, 곤충의 사체등 다양한 곳에서 분리되는 것으로 알려져 있는데 본 연구에서는 풍뎅이류 곤충의 사체로부터 B.t를 분리하여 딱정벌레목 및 나비목 해충에 대한 생물활성 검정을 하여 살충활성이 우수한 균주를 선발하였으며 SDS-PAGE를 수행하였다. 파밤나방에 대한 생물활성 검정 결과, CAB530 균주는 처리 48시간 후에 90%가 넘는 사충률을 보여주었으나 CAB533 균주는 6%의 사충률을 보여주었다. 반면에 장수풍뎅이 유충과 배추벼룩잎벌레 성충에 대해서는 살충활성을 나타내지 않았다. SDS-PAGE 수행 결과 파밤나방에 살충활성이 있는 CAB530 균주는 B.t subsp. kurstaki와 비슷한 130kDa의 밴드를 나타냈으며 파밤나방 중장액으로 소화를 시킨 후에 약 65kDa의 밴드를 확인할 수 있었다. 파밤나방에 대해 살충활성이 적은 CAB533 균주는 65kDa의 독소단백질 밴드를 나타냈지만 파밤나방에 대해서 살충활성이 높지는 않았다.

파리목 모기과에 속하는 모기는 인간에게 질병을 매개하는 위생해충으로 세대기간이 짧으며, 번식력이 강한 특성을 가지고 있다. 인간에게 피해를 주는 모기에 대한 국내의 모기 방제는 대부분 성충을 대상으로 분무식 화학농약을 처리하였으나성충의 휴식 및 행동습성 그리고 정확한 서식처에 직접 접촉을 해야 방제효과를 얻을 수 있다는 점에서 방제에 어려움이 있다. 본 연구에서는 피해의 본질적인 원인이 되는 모기 유충을 대상으로 곤충 살충성 단백질을 생성하는 Bacillus thuringiensis(이하Bt)균주를 선발하여 친환경적인 모기 방제에 대한 실험을 수행하였다. 국내의 토양에서 Spherical type의 Crystal을 형성하는 19개 균주를 위상차 현미경으로 확인 후 모기에 가장 높은 활성을 보인 B.thuringiensis subsp. israelensis CAB191균주를 선발 대량배양하였다., 생물검정은 현재 시판중인 B.t.i 약제(B제품) 와 에스메토프렌을 주성분으로 하는 천연 식물성 테르페노이드 화합물인 약제(A제품)를 대조구로 사용하였다. 대상 해충은 이집트숲모기(Aedes aegypti), 이나도미집모기 (Culex inatomii), 지하집모기(Culex pipiens molestus)의 3령 유충으로 생물 검정을 수행하였다. CAB191균주와 B제품은 103cfu/ml에서 이집트숲모기, 이나도미집모기, 지하집모기에 90%이상의 높은 사충률을 보였다. 반면 A제품은 1,000배 희석액에서 48시간 후 검정시 10%정도의 사충률을 보였다. 이로써 CAB191균주와 B제품이 활성이 높음을 알 수 있었다. 또한 B.t.i와 B제품, CAB191, 대조 균주로 B.t.morrisoni의 단백질 패턴을 분석하기 위하여 SDS-PAGE한 결과 CAB191, B제품이 B.t.i와 동일한 130, 72, 27KDa의 밴드를 형성함을 알 수 있었다.

자연형 습지나 인공습지 형태의 자연정화시설은 축산폐수, 농경배수, 생활하수 등이 직접 하천으로 유입되는 것을 방지하는 수질개선효과를 가지고 있다. 습지는 수질개선의 측면뿐 아니라 여러 종류의 생물의 서식처를 제공함으로서 종다양성을 증진시키며, 자연생태계의 생물들을 관찰할 수 있는 생태공간으로 제공되고 있다. 그러나 인공습지 및 자연습지는 모기나 파리와 같은 위생해충의 주요 집단서식처가 되어 문제가 되고 있다. 일반적으로 모기방제는 주로 성충을 대상으로 화학적 방제에 의존하여 왔으나 수질개선을 목적으로 조성된 자연정화시설에서는 친환경적인 방법이 요구되고 있다. 따라서 본 실험에서는 모기유충을 대상으로 곤충병원성미생물인 Bacillus thuringiensis subsp. israelensis을 이용하여 모기유충의 밀도를 감소시키고자 하였다. 먼저 6월말부터 10월말까지 자연형습지와 인공습지의 모기유충밀도변동추이를 조사한 결과, 9월초까지의 습지내 유충의 밀도는 계속적인 증가추세를 보였는데, 인공습지보다 자연형습지에서의 모기유충발생량이 높았다. 트랩을 통해 포획된 성충의 경우에도 자연형습지에서 높게 나타났다. 발생최성기인 7월말부터 8월말까지 습지내에 곤충병원성미생물을 처리하여 밀도 감소의 효과를 확인하였으며, 살충효과가 우수한 Bti를 습지에서 효과적으로 사용하기 위해 모기유충의 행동습성을 고려하여 수화제(WP)와 액상수화제(SC) 두가지 형태로 제형화하여 살포한 결과, 액상수화제형태의 곤충병원성미생물제제가 밀도감소효과가 더 높게 나타났으며, 습지내에 모기유충방제를 위해 처리하기에도 용이하였다.