본 연구는 소 배반포의 내부 세포괴로부터 다능성(pluripotency)을 지닌 배아 줄기 세포(embryonic stem cell) 또는 그 유사 세포를 분리 및 배양함으로써 줄기 세포 관련 분야의 기반 기술을 확립하고자 하였다. 소 체외수정란을 10～12일간 체외배양하여 생산된 부화 배반포를 세포분열이 불활성화된 생쥐 태아 섬유아 세포(mouse embryonic fibroblast, MEF) 위에서 배양하여 콜로니 형성을 유도하였으며, 이들로부터 내부 세포괴 유래의 형태를 지닌 것만을 광학현미경 하에서 물리적으로 분리하여 약 5～7일 간격으로 계대배양을 실시하였다. 이러한 방법을 통하여 배아 줄기 유사 세포의 특성을 40계대 이상 유지하는 2개의 세포주를 확립하였다. 각각의 세포주들은 높은 alkaline phosphatase(AP) 활성을 지니고 있었으며, 형광 면역 염색법과 PCR 기법을 사용하여 Oct-4, Nanog, STAT3, SSEA3 및 SSEA4의 발현을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 ,본 연구에서는 소 배반포로부터 배아 줄기 세포주를 확립하는 제반 기술이 확립되었다고 판단되며, 향후 관련 분야 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구는 소의 초기 난할 단계인 2 또는 4세포기 수정란의 특정 분할구가 배반포 단계의 내부 세포괴(Inner Cell Mass) 와 영양막 세포(Trophectoderm cells)로의 발달 운명이 미리 정해지는 지를 확인하기 위해 실시되었다. 먼저 생쥐의 체내 수정란과 소의 체외 수정란에서 배반포의 영양막 세포에서만 특이적으로 발현하는 cdx2 단백질의 발현 양상을 조사하였다. 또한, 소의 경우 2세포기와 4세포기가 내부 세포괴와 영양막 세포로 나눠지는 시점인지를 조사하기 위해 2 또는 4세포기의 특정 분할구에Dextran의 주입 실험과 분할구 제거 실험을 통해 ICM과 TE 형성을 확인하였다. cdx2의 발현 경향은 생쥐와 소의 2세포기일 때 대칭과 비대칭적으로 발현되는 것을 확인하였다. 생쥐의 4, 8세포기 및 상실배기에서는 분할구 전체에서 발현되었으나, 소 수정란의 분할구에서는 전체 또는 부분적으로 발현되었다. 또한, 생쥐와 소의 배반포기에서는 영양막 세포에서만 발현이 되는 것을 확인하였다. 소 수정란의 2세포기와 4세포기 단계에서 특정 분할구에 주입된 Dextran은 배반포의 내부 세포괴와 영양막 세포의 양쪽에 분포된 것을 관찰할 수 있었다. 2세포기 단계에서 하나의 분할구가 제거된 수정란 역시 ICM 및 TE 세포를 지닌 정상 배반포로 발달함을 확인하였다. 따라서 본 연구 결과는 영양막 세포에서만 특이적으로 발현하는 cdx2의 발현이 2 또는 4세포기 단계 소 수정란에서는 특별한 차이를 보이지 않으며, 궁극적으로 난할 초기에는 ICM과 TE 세포로의 운명이 결정되지 않는다는 것을 보여준다.

형질전환 동물의 유선에서 특이적으로 발현되도록 고안된 pBIL-10 발현 벡터를 이용하여 인간 IL-10 유전자가 삽입되어 한 계통으로 확립된 형질전환 생쥐에서 이 유전자가 장기 세대까지 안정적으로 전이되고, 또한 발현 수준도 지속적으로 유지되는지를 조사하였다. 이를 위해 제 8 세대의 수컷 hIL-10 형질전환 생쥐를 실험에 공시하였고, 제 15 세대까지의 전이율과 hIL-10 유전자의 발현 수준을 분석하였다, 제 8 세대 생쥐의 계대 번식에 의한 자손 중 50.9±5.8％가 형질전환 생쥐로 판명되었다. 또한 제 9 세대에서 외래 유전자의 전이율은 66.0±20.1％이렀고, 제 10 세대에서 외래 유전자의 전이율은 61.5±16.7％이었고, 제 11 세대에서 외래 유전자의 전이율은 41.1±8.4％이었고, 제 12 세대에서 외래 유전자의 전이율은 40.7±20.3％이었고, 제 13 세대에서 외래 유전자의 전이율은 61.3±10.8％이었고, 제 14 세대에서 외래 유전자의 전이율은 49.2±18.8％이었고, 제 15 세대에서 외래 유전자의 전이율은 43.8±25.9％이었다. 이러한 결과로 hIL-10 형질전환 생쥐는 그 외래유전자의 유전적 손상이 없이 장기 세대까지 안정적으로 전이되는 것으로 판다된다. 제 9 세대의 암컷 형질전환 생쥐로부터 유즙내 인간 hIL-10의 발현 수준을 분석하였을 때, 그 농도는 평균 3.6± 1.2 mg/ml의 수준에서 측정되었다. 제 10세대에서는 유즙내 인간 hIL-10의 발현 수준을 분석하였을 때, 그 농도는 평균 4.2±0.9 mg/ml의 수준에서 측정되었고, 제 11세대에서는 유즙내 인간 hIL-10의 발현 수준을 분석하였을 때, 그 농도는 평균 5.7± 1.5 mg/ml의 수준에서 측정되었고, 제 12세대에서는 유즙내 인간 hIL-10의 발현 수준을 분석하였을 때, 그 농도는 평균 6.3±3.5 mg/ml의 수준으로 측정되었고, 제 13세대에서는 유즙내 인간 hIL-10의 발현 수준을 분석하였을 때, 그 농도는 평균 6.8±4.5 mg/ml의 수준으로 측정되었고, 제 14세대에서는 유즙내 인간 hIL-10의 발현 수준을 분석하였을 때, 그 농도는 평균 6.8±3.1 mg/ml의 수준으로 측정되었다. 이러한 수준은 제 1 세대의 것보다 높은 결과로 형질전환 생쥐에서 인간 IL-10 유전자의 발현은 최소한 15 세대까지 지속적으로 유지된다는 것을 알 수 있었으며, 장기 세대까지도 발현수준이 유지될 것으로 판단된다. 이러한 연구결과는 계통으로 확립된 형질전환 동물에 부여된 새로운 유전형질은 지속적으로 후대로 유전될 수 있음을 제시한다.

본 연구는 돼지난포란의 체외배양액에 황화합물인 Catalase 첨가 및 저분압산소조건 하에서 첨가배양함으로서 돼지난포란의 체외성숙과 체외배발달에 미치는 영향을 구명하고자 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 돼지난포란을 체외성숙배양액인 0.9mM cy-steine이 함유된 NCSU-23 배양액에 CAT를 각각 0, 100, 500 및 1000uni1s/m1 첨가하여 체외성숙 및 수정을 실시한 결과, 모든 평가요소에서 처리구가 대조구에 비하여 유의적으로 낮은 결과를 나타내어 체외수정에 좋지 않은 영향을 미치는 것으로 판단된다(P>0.05). 2. 체외수정을 실시한 후, 배발달배양액인 NCSU-23에 7일 동안 배양한 결과, 배반포형성률과 총세포수에 있어서 처리구가 대조구에 비하여 유의적으로 낮은 결과를 나타내어 체외성숙시 CAT 첨가배양은 배발달에 좋지 않은 것으로 판단된 다(P>0.05). 3. 배발달배양액인 NCSU-23에 CAT를 각각 0, 100, 500 및 1000units/m1을 첨가하고 5 및 20% 산소농도하에서 7일간 배양을 실시한 결과, 산소농도에 따른 차이는 인정되지 않았으며, CAT 첨가에 따른 배반포형성률과 총세포수에 있어서도 처리구가 대조구보다 유의적으로 낮은 결과를 나타냈다(P>0.05). 결론적으로 돼지난포란을 이용하여 체외수정란을 생산할 때, NCSU-23 배양액에 catalase의 첨가 및 산소조건은 영향을 미치지 않는 것으로 조사되었다.

형질전환 동물의 유선에서 특이적으로 인간 TPO가 발현되도록 고안된 pBT-L 외래유전자가 삽입되어 한 계통으로 확립된 형질전환 생쥐에서 이 유전자가 장기 세대까지 안정적으로 전이되고, 또한 발현 수준도 지속적으로 유지되는지를 조사 하였다 이를 위해 제 5세대의 수컷 pBT-L 형질전환 생쥐를 실험에 공시하였고, 제 10세대까지의 전이율과 인간 TPO의 발현수준을 분석하였다. 제 8세대 생쥐의 계대 번식에 의한 자손 중 51.3±18.98%가 형질전환 생쥐로 판명되었다. 또한 제9세대에서 외래 유전자의 전이율은 43.8±18.98%이었고, 제 10세대에서는 71.4±26.98%의 전이율을 나타내었다. 이러한 결과로 pBT-L 형질전환 생쥐는 그 외래유전자의 유전적 손상이 없이 장기 세대까지 안정적으로 전이되는 것으로 판단된다. 제 9세대외 10세대의 3마리의 암컷 형질전환 생쥐로 부터 유즙내 인간 TPO의 발현 수준을 분석하였을때, 그 농도는 모두 평균 1.1 mg/ml의 수준에서 측정되었다. 이러한 수준은 제 2세대의 것과 유사한 결과로 pBT-L 형질전환 생쥐에서 인간 TPO 유전자의 발현은 최소한 10세대까지 지속적으로 유지된다는 것을 알 수 있었고, 더 긴 장기 세대까지도 발현 수준이 유지될 것으로 추정된다. 이러한 연구결과는 계통으로 확립된 형질전환동물에 부여된 새로운 유전형질은 장기 세대까지 유전될 수 있음을 보여주는 것이다.

Mercaptoethanol(-ME)은 일반적으로 황화합물(thiol compounds)의 일종으로, 배양액 중에서 이황화결합(disulfide bonds)을 분해하여 일정한 물질의 산화.환원반응에 관여하며, 특히 cysteine이 cystine으로 산화되는 것을 차단함으로서 cysteine의 이용능력을 증대시키고, GSH의 합성을 촉진 및 증대시키는 것으로 알려져 있고, 각종 활성산소로부터 세포를 보호하는 역할을 수행하는 것으로 보고되었다. 특히, 돼지수정란의 체외배양체계에 유의적인 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Abebydeera 등, Theriogenol., 50:747-756, 1998). 따라서 본 실험에서는 돼지난포란의 체외성숙시 -ME의 첨가배양이 체외수정과 배발달에 미치는 영향에 관하여 조사하였다. 돼지난포란을 10% PFF, 0.1mg/ml cysteine, 10IU/m1 PMSG, 10IU/m1 hCG 및 10ng/m1 EGF가 첨가된 NCSU23 배양액에 -ME를 각각 0, 25, 50 및 100uM을 처리하여 22시간 동안 배양을 실시하고, 성선자극호르몬이 배제된 배양액에서 추가로 22시간을 배양하여 체외성숙을 유도하였다. 체외성숙이 유기된 난자는 난구세포를 제거하고, 2.5mM caffeine과 0.1% BSA가 첨가된 mTBM배양액에 정자를 1.25 cells/ml의 농도로 5-6시간 동안 공동배양을 실시하여 체외수정을 유도하였다. 체외수정후 일부의 수정란은 12시간에 난자 급속 염색방법으로 염색하여 다정자침입률 및 자.웅전핵형성률 등을 확인하였다. 그리고 나머지1-세포기의 수정란은 0.4mg/ml BSA가 함유된 NCSU23 배양액에 30 embryos/50ul 소적으로하여 38.8, 5% 의 탄산가스 배양기에서 각각 7일간 배양을 실시하였다. 조사된 결과는 SAS/STAT를 이용하여 통계분석을 실시하였다. 체외수정 12시간 후에 난자 급속 염색법으로 염색을 실시한 결과, 모든 처리구에서 핵성숙률(76.4~95.2%), 정자침투율(51.1~66.9%), 웅성전핵형성률(95.2~100%), 다정자침입률(18.2~25.6%) 및 평균침입정자수(1.2~l.4개)에서 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 체외배양 48시간 난할률을 조사한 결과, 처리구별 차이(53.9~67.9%)는 인정되지 않았으나, 배양 7일째 배반포형성률은 각각 14.5, 25.4, 17.3 및 12.4%로서 25uM의 -ME처리구가 유의적(P<0.05)으로 높은 배발달률을 나타내었고, 총세포수에 있어서는 대조구와 처리구간 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 따라서 돼지 난포란을 성숙배양할 때, 25uM -ME를 첨가배양하는 것이 양질의 돼지체외수정란을 생산하는 하나의 방법으로 조사되었다.다.

The pronuclear injection of metallothionein-human growth hormone (MT-hGH) gene into rabbit zygotes was performed to establish in vitro developmental system and to detect the presence of the injected gene by nested PCR. Mature female New Zealand White rabbits were superovulated by eGG and hCG treatments. The rabbits were mated and the zygotes were collected from the oviducts 18-22 h after hCG injection by flushing with D-PBS. Two to three picoliters of MT-hGH gene was microinjected into male pronuclei. The foreign gene-injected zygotes were cultured in TCM-199 or RD mediurn containing 10% FCS with a monolayer of rabbit oviductal epithelial cefls in a 5% incubator. The presence of injected DNA in rabbit embryos or blastomeres at different developmental stages .vas detected by a nested PCR analysis. The results are summarized as follows ; 1.The developmental rate of the MT-hGH gene-injected zygotes to blastocyst was significantly higher in TCM-199 medium (68.1%) than in RD medium (42.9%). 2.The gene injection into pronuclei at 18 or 22 hours post hCG treatment during pronuclear stage did not much affect on the in vitro development of the rabbit embryos. 3.The rate of gene-positive embryos detected by the nested PCR analysis was significantly decreased when they developed to blastocysts. The results indicate that the screening of transgene in rabbit embryos by nested PCR analysis could be a prornisible method for the preselection of transgenic embryos. Furthermore, the preselection of transgenic embryos would greatly reduce hoth the cost and effort of production of transgenic animals.