Tissue engineering (TE) has been developed to create functional organs and tissue by combining 3D matrix and cells in vitro. Vascularization and angiogenesis are utmost important for supply of nutrients and oxygen in tissue engineered organs. The present study was performed to isolate and characterize primary endothelial cells (EC) from aorta of alpha 1, 3-enzyme galactosyltransferase knock out (GalT KO) pig, to minimize immune rejection and analyze body immune system for future xenotransplantation studies. Isolation of primary EC from aorta were performed by incubation with dispase for 8-10 min at 37°C. Primary EC were cultured in EC growth medium on different extra cellular matrix (ECM), either collagen or gelation. Primary EC exhibits morphological characteristics and showed positive expressions of EC specific marker proteins i.e. PECAM1, KDR and VWF despite of their ECM surface; however, on collagen based surface they showed increase in mRNA level analyzed by qPCR. Primary EC cultured on collagen were sorted by flow cytometer using KDR marker and cultured as KDR positive cells and KDR negative cells, respectively. KDR positive cells showed dramatically increased in PECAM1 and VWF level as compared to KDR negative cells. Based on the above results, primary EC derived from GalT KO are successfully isolated and survived continuously in culture without becoming overgrown by fibroblast. Therefore, they can be utilize for xeno organ transfer, tissue engineering, and immune rejection study in future.

With the multiple practices of bone graft using different artificial bone regenerative substitutes, the bone graft procedures have been widely performed to increase the bony stabilization of dental implant. Xenogenic bone graft materials have been well developed because of their good biocompatibility and abundant source of bone materials. The present study demonstrated the histological findings from excellent bony remodeling in xenogenic bone graft biopsies compared to those findings in autogenous bone graft. For the graft bone biopsies which were usually done in 5-9 months after graft bone insertion, five types of histological grades including excellent, favorable, partial, degenerative, and poor bony remodeling could be assessed to give prognostic information for dental implant. However, recently the xenograft bone materials have been much improved and produced strong osteogenic effect. Among 239 cases of trephine bur-supported core bone biopsy the excellent bony remodeling was found in 20 cases (13.1%) out of 153 xenogenic bone grafts and in 13 cases (43.3%) out of 30 autogenous bone grafts. They produced abundant new bones on the surface of the graft bones in 5–9 months, and the graft bones were partly resorbed and also surrounded by the repetitive deposition of new bone. The osteophytic new bones showed strong birefringence under polarizing microscope, and were gradually elongated and anastomosed with each other to form trabecular bony networks which became proper stress-baring structures for dental implant. Their marrow stromal tissues were composed of loose connective tissue which was well vascularized but rarely infiltrated with inflammatory cells. The present study compared the histological features of excellent bony remodeling between xenogenic and autogenous bone grafts. Although the ratio of excellent bony remodeling in xenogenic bone graft was still low, 13.1%, the recent advance of xenogeic bone products was remarkable in biological aspect and almost comparable to the autogenous bones. Therefore, it was suggested that the xenogenic bone graft will be applicable to the bone regeneration procedures for dental implant with beneficial output in the near future.

포유동물 생식세포를 생산하는 정자형성과정은 정원줄기세포 (spermatogonial stem cells, SSCs)가 일생 동안 정소 내 기저부에 존재하면서 계속적인 증식을 통해 그 수를 유지하고, 그 중 일부가 감수분열에 진입하여 남성생식세포인 정자를 생산하는 일련의 과정이다. 신생 및 성체의 정원줄기세포는 의학과 접목하여 불임 및 저출산 치료에 크게 기여할 것으로 사료되어, 이미 많은 연구자에 의하여 활발히 연구가 진행되고 있다. 그러나 이중 성체 정소 유래의 정원줄기세포는 신생 정소에 비하여 체세포당 비율이 매우 낮아 이를 분리하여 배양하기 위해서는 효율 높은 정원줄기세포의 분리 방법의 개발이 필요하다. 따라서 본 연구는 인간에 적용하기에 가장 적합하다고 생각되는 조직이식 방법을 통하여 성체 생쥐의 정원줄기세포를 과밀화하고, 이렇게 얻어진 세포를 체외에서 배양하고자 하였다. 6～8주령의 정상적인 정자형성과정이 일어나고 있는 성체 생쥐 (BDF1)의 정소를 분리하였고, 정소 내 존재하는 분화된 생식세포를 줄여주기 위하여 면역이 결핍된 누드마우스의 등쪽에 이식하였다. 이때 생착효율을 알아보기 위하여 실험군은 3개 (whole testis under dorsal skin, slice testis under dorsal skin and whole testis in the abdominal cavity)의 그룹으로 나누어 이식하였다. 이식 2～4주 후 이식한 정소 조직을 채취하여 일부는 기존의 방법 (정소 조직의 이식방법을 사용하지 않은 대조군)과 비교해서 조직이식을 시행 후 세정관내 존재하는 정원줄기세포의 비율을 조직화학적 방법으로 비교 분석하였다. 나머지 조직은 개개의 세포로 분리하여 정원줄기세포의 증식 및 유지에 필요한 성장인자 (GDNF, bFGF, LIF, EGF, IGF-1)를 첨가한 후 배양하였으며, 7～10일마다 계대배양하였다. 배양된 세포는 RT-PCR, AP staining, TUNEL staining, Immunocytochemistry 및 FACS analysis를 통하여 정원줄기세포 특징을 분석하였다. 이식 2주 후 3그룹 내 정원줄기세포가 포함되어 있는 비율은 각각 93% (13/14), 92% (12/13), 57% (4/7)로 나타났으며, 이식된 조직의 seminiferous tubules내에는 분화된 생식세포가 사라지거나 퇴화된 것을 확인하였다. TUNEL assays를 통하여 Whole과 Sliced testis 그룹에서는 7.3±3.3%과 8.3±3.9% 만이 세포사가 진행되는 세포를 관찰한대 반하여 Abdominal cavity에 이식한 군에서는 70.9±16.2%로 매우 높은 세포사율을 관찰하였다. 체외배양 기간 동안 정원줄기세포의 colonization 효율은 이식하지 않은 대조군에 비하여 높게 관찰하였다. 조직 이식 후 배양한 성체 유래 정원줄기세포는 위 성장인자가 포함된 배양액에서 2.5달 (8계대) 동안 성공적으로 유지 배양되었다. 배양된 세포는 정원줄기세포의 특징인 AP activity를 강하게 나타냈으며, 표지인자인 Thy-1와 GFRα-1 또한 강하게 발현되는 것을 FACS와 Immunocytochemistry를 통하여 확인하였다. 또한 RT-PCR를 통하여 정원줄기세포 표지유전자 마커인 integrin β1, mvh, ngn3 mRNA는 강하게 발현되는데 비하여 생식세포 분화유전자 마커인 piwil2, stra8, c-kit, TH2B and TP-1 mRNA는 발현되지 않거나 약하게 발현되었다. 조직이식을 통하여 성체 내 존재하는 극소수의 성체 정원줄기세포의 분리 및 배양이 가능함을 확인하였다. 이러한 생쥐 모델 시스템을 인간에게 적용할 경우 autologous한 조직이식을 통해 단순화된 방법으로 정원줄기세포 분리 및 배양이 가능할 것으로 사료된다.