The bitterling (Cyprinidae, Acheilongnathinae) is a temperate freshwater fish with a unique spawning symbiosis with host mussels. Female bitterlings use their extended ovipositors to lay eggs on the gills of mussels through the mussel's exhalant siphon. In the present study, in April of 2020, we investigated spawning frequencies and patterns of three bitterling fish species in host mussel species in the Nakdong River basin (Hoecheon). During field surveys, a total of four bitterling and three mussel species were found. We observed bitterling's spawning eggs/larvae in the three mussel species: Anodonta arcaeformis (proportion spawned: 45.5%), Corbicula fluminea (12.1%), and Nodularia douglasiae (45.2%). The number of bitterlings’ eggs/larvae per mussel ranged from 1 to 58. Using our developed genetic markers, we identified the eggs/ larvae of each bitterling species in each mussel species (except for A. macropterus): A. arcaeformis (spawned by Acheilognathus yamatsutae), C. fluminea (A. yamatsutae and Tanakia latimarginata), and N. douglasiae (A. yamatsutae, Rhodeus uyekii, and T. latimarginata). Approximately 57.6% of N. douglasiae mussel individuals had eggs/ larvae of more than one bitterling species, suggesting that interspecific competition for occupying spawning grounds is intense. This is the first report on bitterling’s spawning events in the Asian clam C. fluminea from Korea; however, it should be ascertained whether bitterling’s embryo undergoes successful development inside the small mussel and leaves as a free-swimming juvenile. In addition, the importance of its conservation as a new host mussel species for bitterling fishes needs to be studied further.

본 연구는 2015년 8월부터 2016년 7월까지 납지리의 말조개 내 산란과 적응특성을 조사하기 위해서 만경강 봉서천 일대에서 수행하였다. 납지리의 산란기는 9-11월까지로 추정되었고 성숙한 암컷에서 확인된 알수는 17-75개(36.2 ± 16.44)였다. 조사기간 동안 확인된 조개는 476개체이었고 납지리의 산란이 확인된 조개는 129개체(27.1%)였다. 납지리의 알과 자어가 산란된 조개(46.3 ± 4.55 mm, n = 129)가 산란되지 않은 조개(42.6 ± 8.51 mm, n = 347)보다 더 큰 것으로 나타났다. 안구가 형성되기 전 납지리 자어와 형성된 후 자어의 출현 비율은 2015년 10월부터 2016년 3월까지는 99.8% (n = 597) vs. 0.2% (n = 1)이었고, 4월에는 25.6% (n = 23) vs. 74.4% (n = 67), 5월에는 0% (n = 0) vs. 100% (n = 40)로 확인되었다. 말조개 안에서 확인된 납지리 알과 자어수는 1-18개(5.6 ± 3.81)로 나타났다. 아가미 위치에 따른 납지리 알과 자어수 및 출현빈도는 왼쪽 외반새 1개(0.01 ± 0.09, n = 1), 0.78%, 왼쪽 내반새 1-18개(2.33 ± 3.31, n = 63), 48.84%, 오른쪽 내반새 1-15개(2.97 ± 3.79, n = 76), 58.91%, 오른쪽 외반새 1-12개(0.33 ± 1.71, n = 7), 5.43%로 나타났다. 납지리 알과 자어의 아가미에서 발생위치는 안구 형성 전에는 lower part 3 (L3)에서 71.8% (n = 445), 안구 형성 후에는 L3에서 94.4% (n = 102)로 다른 부위보다 L3에서 모두 높게 나타났다. 납지리의 알과 자어수 및 출현빈도는 조개의 내반새가 외반새보다 높게 나타났다. 납지리는 추계산란종으로 다른 납자루아과 어류나 글로키디아 조개 유생과의 조개 안에서의 경쟁은 피하는 장점이 있지만 낮은 수온의 겨울을 보내야 한다. 이에 납지리는 안구형성 전인 낮은 수온에서는 배아적 휴면(embryonic diapause)을, 안구형성 후에는 수관에서 상새방 으로의 이동에너지 절약을 위한 상새방 내 산란이라는 방향으로 적응해 온 것으로 판단된다.

본 연구는 2015-2018년 5월 기간 동안 납자루아과 어류의 서식 집단 중 강원도 홍천 내촌천(HN), 덕치천(HD), 정선 골지천(JG) 및 조양강(JJ)을 대상으로 기 개발된 제한절편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism; RFLP) 분자마커를 이용하여 숙주조개 속 난 및 치어에 대한 정확한 종 동정을 수행 후 납자루아과 어류의 숙주조개 크기에 대한 산란양상을 파악하고자 하였다. 연구대상 지역 내 납자루아과 어류는 내촌천과 골지천에서 1종(묵납자루; Acheilognathus signifer), 덕치천에서 3종(각시붕어; Rhodeus uyekii, 묵납자루; A. signifer, 줄납자루; Acheilognathus yamatsutae), 조양강에서 2종(묵납자루, 줄납자루)으로 확인되었고, 네 지역에서 모두 동서하고 있는 숙주조개인 작은 말조개(Unio douglasiae sinuolatus) 982개체를 채집하였다. RFLP 분자마커를 이용하여 납자루아과 어류의 난 및 치어가 확인된 작은말조개(N=163; 16.6%)에서 총 646개체의 납자루아과 어류의 난 및 치어(묵납자루 454, 줄납자루 43, 각시붕어 149개체)를 확인하였다. 각 지역 숙주조개 크기에 따른 산란선호도를 조사하기 위해 난 및 치어가 확인된 숙주조개(mussels with [presence] eggs/fry)와 확인되지 않은 숙주조개(mussels without [absence] eggs/fry)의 각장 (shell length), 각고(shell height) 및 각폭(shell width)의 평균 크기를 비교하였다. 그 결과 3종의 납자루아과 어류가 동서하는 덕치천의 경우 난 및 치어가 확인된 숙주조개가 확인되지 않은 숙주조개보다 각장(1.98mm), 각고(0.85mm), 각폭(0.73mm)의 크기가 통계적으로 유의하게 크게 나타났으며(Mann-Whitney U tests, P=0.002, P=0.012, P=0.009), 다른 세 개의 지역에서도 난 및 치어가 확인된 조개의 각장, 각고, 각폭의 크기가 큰 결과를 보였으나, 통계적으로 유의하지는 않았다. 추가적으로 종 간 숙주조개 당 평균산란 난 및 치어의 수를 분석한 결과 각시붕어 9.31±5.94개, 묵납자루 2.86±2.45개, 줄납자루 2.50±1.32개로 각시붕어는 묵납자루와 줄납자루보다 숙주조개 당 평균 6.45~6.81개 더 많이 산란하였고, 통계적으로 유의한 결과를 나타내었다(Kruskal-Wallis test, P<0.001). 이 결과는 본 연구 대상 납자루아과 어류 3종에서 크기가 큰 작은말조개를 산란을 위한 숙주로서 선호함을 의미하고, 조개 크기에 대한 선호도 차이가 동서하는 납자루아과 종의 수가 많을수록 크게 나타났다. 또한, 묵납자루와 줄납자루의 경우 많은 숙주조개에 적은 양의 난을 추가적으로 고르게 산란하는 반면에 각시붕어는 비교적 적은 수의 숙주조개에 많은 양의 난을 산란하는 번식전략을 나타내었다. 2종 이상의 납자루아과 어류가 서식하는 덕치천(HD)과 조양강(JJ)에서 묵납자루와 줄납자루 2종이 동일한 조개에 산란하는 것이 관찰되었다(N=4). 이는 납자루아과 어류가 2종 이상 동서할 때, 동일한 자원인 작은말조개를 자신의 산란숙주로 이용하기 위한 종간경쟁(interspecific competition)이 일어나고 있는 것으로 판단된다. 본 연구에서는 기존 연구된 생태학적 연구에 유전학적인 방법을 추가하여 각 집단 간, 종 간 숙주조개 크기에 대한 산란양상을 보다 정확히 규명하여 숙주조개를 이용하는 납자루아과 어류의 생태적 적응양상을 명확히 파악하고 더 나아가 숙주조개와 납자루아과 어류의 공생(mutualism) 혹은 숙주-기생의 상호관계(host-parasite relationship)를 규명 하는데 기여할 수 있을 것으로 기대한다.

본 연구는 PCR 기반 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한절편 길이 다형성) 분자기법을 활용하여 난 및 치어 대상 납자루아과 어류 3종의 동정을 좀 더 빠르고 정확하게 파악하고 납자루아과 어류의 종별 산란양상 및 번식생태 이해에 대한 기여가 목적이다. 본 연구를 위해 기존 선행된 문헌자료를 확인하고 납자루아과 어류가 2종 이상 동서하고 있는 지역을 확인하여 현지조사를 수행하였다. 현지조사 결과 확인된 납자루아과 어류는 묵납자루 (Acheilognathus signifer), 줄납자루 (A. yamatsutae) 및 각시붕어 (Rhodeus uyekii)로 총 3종이 확인되었으며, 확인된 납자루아과 어류와 동서하고 있는 숙주조개 (작은말조개; Unio douglasiae sinuolatus)를 채집하여 숙주조개 속 납자루아과 어류의 난 및 치어를 확보하였다. 현지조사 결과 확인된 납자루아과 어류 3종을 대상으로 미토콘드리아 DNA COI과 cyt b 유전자 염기서열을 비교하여 각각 종별로 특이성을 지닌 부위 (단일염기변이; Single Nucleotide Variation: SNV)에 맞는 제한효소를 선정하였고, 숙주조개 속 난 및 치어를 대상으로 genomic DNA를 추출하여 PCR-RFLP 실험을 수행한 결과 현지조사 시 확인된 납자루아과 어류 3종의 독특한 제한절편 길이 양상을 전기영동을 통하여 확인하였다. 본 연구를 통해 묵납자루, 줄납자루 및 각시붕어의 종을 판별할 수 있는 RFLP 마커를 개발하였으며, 숙주조개 난 및 치어를 대상으로 정확한 종의 동정을 보다 빠르고 효과적으로 수행하여 각각 납자루아과 종별 산란양상을 보다 정확히 규명하고 향후 이들 자연개체군의 효과적인 유지, 관리 및 보전 방법 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

본 연구는 PCBs가 칼납자루의 생식에 미치는 영향을 조직학적인 방법을 사용하여 조사하였다. 0, 3.4, 9.3 그리고 25.8 μg L-1의 PCBs에 8주 동안 노출 실험한 결과, PCBs에 의한 행동과 생존율에는 영향을 미치지 않았다. 대조구와 비교해볼 때 PCBs에 노출된 어류들은 생식소발달, 생식소중량지수 (GSI), 간중량지수 (HSI), 혼인색지수(NCI) 및 산란관지수(OLI)의 차이를 보였다. 이러한 결과는 PCBs

This report describes the sex differentiation of the Korean rose bitterling, Rhodeus uyekii, from hatching to 170 days post-hatch (DPH) in relation to total length (TL), body weight (BW), and integral water temperature (IWT). The growth curve of TL from just hatching to 83 DPH was 5.144e0.045t (R² = 0.961; t, time), and that of BW was 2.398e0.086t (R² = 0.725). Primordial germ cells (PGCs) were observed at 17 DPH (7.9 mm TL, 3.74 mg BW, 374°C IWT), and thereafter began to protrude into the peritoneal cavity. At 21 DPH (9.2±0.14 mm TL, 4.8±0.07 mg BW, 462°C IWT), some PGCs contained condensed chromatin and oocyte were observed in meiotic prophase. In contrast to the ovaries, which grew gradually after sexual differentiation, testes began multiplying at 25 DPH (10.1 mm TL, 5.42 mg BW, 550°C IWT), when testicular differentiation was first identified, and multiplied continuously thereafter. At 33 DPH (11.2 mm TL, 10.5 mg BW, 726°C IWT), the developing testes contained spermatogonia that exhibited mitotic activity. No spermatocyte or sperm cell was observed until 83 DPH (18.9 TL, 48.2 mg BW, 1,826°C IWT). At 170 DPH (32.5 mm TL, 270.1 mg BW, 3,740°C IWT), which was the end point of this study, the mature ovaries showed germinal vesicle breakdown, while the mature testes contained observable spermatocytes and sperm cells. These results allow us to identify the sex differentiation type of the Korean rose bitterling as differentiated gonochoristic.

Heat shock protein (HSP) 70, the highly conserved stress protein families, plays important roles in protecting cells against heat and other stresses in most animal species. In the present study, we identified and characterized four Hsp70 (RuHSP4, RuHSC70, RuHSP12A, RuGRP78) family proteins based on the expressed sequence tag (EST) analysis of the Korean rose bitterling R. uyekii cDNA library. The deduced RuHSP70 family has high amino acid identities of 72-99% with those of other species. Phylogenetic analysis revealed that RuHsp70 family clustered with fish groups (HSP4, HSC70, HSP12A, GRP78) proteins. Quantitative RT-PCR analysis showed the specific expression patterns of RuHsp70 family members in the early developmental stages and several tissues in Korean rose bitterling. The expression of 4 groups of Hsp70 family was detected in all tested tissue. Particularly, Hsp70 family of Korean rose bitterling is highly expressed in hepatopancreas and sexual gonad (testis and ovary). The expression of Hsp70 family was differentially regulated in accordance with early development stage of Rhodeus uyekii.

Serine-arginine-rich nuclear protein LUC7L plays an important role in the regulation of myogenesis in mice. In the present study, we isolated and characterized the Korean rose bitterling Rhodeus uyekii Luc7l cDNA, designated RuLuc7l. The RuLuc7l cDNA is 1,688 bp long and encodes a 364-amino-acid polypeptide containing serine/arginine-rich region at the C-terminus. The deduced RuLuc7l protein has high amino acid identity (71-97%) with those of other species including human. Phylogenetic analysis revealed that RuLUC7L clustered with fish LUC7L proteins. The expression of RuLuc7l mRNA was high in the brain, kidney, and stomach of Korean rose bitterling. Expression of the RuLuc7l mRNA was detected from 1 day post-fertilization (dpf) and moderately increased until 21 dpf during the early development. Further investigations are required to elucidate the functional role of RuLUC7L in myogenesis in R. uyekii.

We investigated the process of yolk absorption in Korean rose bitterling, Rhodeus uyekii, and determined the changes in its morphometric characteristics. The R. uyekii from 1 days post hatching (DPH) to 21 DPH, the eye diameter (ED) was 5.4 at 5 DPH. Thereafter, the ED/total length (TL) ratio increased to 10.7 at 21 DPH (p<0.05). The yolk length (YL) decreased from 95.4 to 1.1 by 21 DPH, and this rate of decrease was greater than that for any other dimension (p<0.05). 12 morphometric dimensions/TL for the R. uyekii were measured at each sampling day from 21 DPH to 170 DPH. At just hatching, the average TL and BW were 6.1±0.09 mm and 4.9±0.07 mg, respectively. At 53 DPH, the average TL was 12.9±0.28 mm and the average BW was 14.7±0.72 mg; the total length growth equation was TL=5.507e0.038t (R²=0.916). Further, the body weight growth equation was BW=3.3647e0.0296t (R²=0.9354). The dimensions with regard to body depth showed the greatest growth rates in the external characteristics of the fish (p<0.05). The patterns of the morphometric characteristics measured in this study can be classified in three ways. The patterns were shown to be increased (y=0.0992x+ 12.07, R²=0.8333), decreased (y=–0.0569x+42.029, R²=0.8395) or maintained (y=0.005x+18.263, R²=0.3678) from 21 DPH to 170. These results will provide useful indices for the successful rearing of the R. uyekii.