Protoplasts were isolated from the primary leaves of lettuce (Lactuca sativa L.) seedlings 10 days after in vitro germination. The leaves were stripped and incubated in an enzyme mixture consisting of 1.2% Cellulase R-10 and 0.3% Macerozyme R-10 in cell and protoplast washing solution (CPW) overnight. The average protoplast yield was 8.25 x 106 protoplasts per g of fresh leaf tissue. When protoplasts were cultured at a density of 3.0 × 105 protoplasts/mL in agarose solid KM8P/KM8 medium, first and second divisions were observed in the protoplasts within a week. Protoplast-derived microcolonies formed after 4 weeks of culture, and visible colonies were present after 3 months of culture. Protoplast-derived microcalli were transferred to Murashige and Skoog medium supplemented with 2.0 mg/L kinetin and 0.1 mg/L NAA and incubated in the light for 3 weeks. They grew into callus, which then regenerated into plants after 7 weeks of culture. The regenerated plants grew as apparently normal flowering fertile plants.

이탈리안 라이그라수(Lolium muliflorum Lam.)의 원형질체 분리 및 생존성에 영향을 미치는 몇가지 요인들에 대하여 조사한 바 다음과 같은 결과를 얻었다. 성숙배. 미숙배 및 유종에 있어서 분화력이 높이 캘러스 유기는 에서 7일간 저온처리와 기본배지에 5mg/을 첨가한 것이 효과적이었다. 캘러스로부터의 재분화는 BAP 0.2mg/l와 2,4-D 2mg/l의 조합에서 가장 좋았다. 유종에서 유기되 현탁배양 세포를 액체배지에서 5일 간 진탕배

This research was conducted to get the basic materials necessary to obtain the somatic hybrid plant between Solanum sisymbriifolium and other Solanum species (S. integrifolium and S. toxicarium). Regarding the formation of colony from the protoplast in S. sisymbriifolium, S. integrifolium and the fused protoplast mixture; for the S. sisymbriifolium, a colony was observed in F medium(Kao medium containing 5.0mg·L-1 NAA, 1.0mg·L-1 2,4-D and 1.0mg·L-1 BA); and for the S. integrifolium, in G medium (a half strength MS medium containing 0.03 M sucrose, 0.4 M mannitol, 1.0mg·L-1 NAA, 1.0mg·L-1 kinetin) respectively. In mixed cultured protoplast after electriofusion treatment, the cell division and colony formation were observed in both media F and G. For the shoot and root formation rate, there was no difference between the parent of each breed and mixed protoplast regardless of the medium. In the fused protoplast mixture of S. sisymbriifolium and S. toxicarium, a colony formation was also observed in both media F and H(a half strength MS medium containing 0.03 M sucrose, 0.4 M mannitol, 1.0mg·L-1 NAA, 1.0mg·L-1 kinetin); and there was no difference in the shoot and root formation rate between the parent and the mixed protoplast.

The isolation of female gametes is precondition for the satisfactory micromanipulation of gametes in common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.). Embryo sacs were isolated at flowering stage after brief treatment with minimal concentrations of cell-wa

Indica 벼의 원형질체들로 부터 효과적인 식물체 재분화 방법을 개발하였다. 이 방법은 배형성 진탕 세포 배양체로 부터 나출된 원형질체들을 feeder cell들이 agarose에 embedded된 배지 표면에 놓인 filter membrane 위에 배양하는 것이다. Feeder cell로서 Lolium multiflorum 세포배양체를 사용했을 때가 Oryza ridleyi를 사용했을 때보다 효과적이었고, 원형질체 평탄효율은 세포 배양체 age에 따라 달랐지만 최고로 0.68％ 까지 증가되었다. Carbohydrate source로서 maltose를 사용하거나 maltose와 sucrose를 1:1로 조합했을 때가 sucrose 단독으로 사용했을 때보다 식물체 재분화율이 증가되었고, 고농도의 agarose를 이용하여 원형질체로부터 유도된 캘러스를 dehydration시켰을 때 또한 재분화율이 괄목하게 증가되었다. 식물체 재분화율은 control 캘러스로부터 3.1∼30.6％ 였지만 dehydration처리한 캘러스로부터는 30.7∼70.7％까지 증가되었다. 원형질체로 부터 유도된 식물체들은 형태적으로 정상이며 개화했다.

작물 원형질체를 배양하면서 세포의 생존과 노화 그리고 고사의 상태를 대사적으로 정확히 판단이 가능한 marker물질을 확인하고 간편한 측정법을 확립하기 위하여 일련의 연구를 수행하였던 바 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 담배와 벼의 원형질체를 나출하여 MS와KM-8P를 기본배지로 하여 2,4-K와 CM을 첨가하였던 바, ABA는 경시적으로 감소하였으며 CM첨가에 의해서 더 많이 감소하였다. GA3 , IAA, zeatin은 반대로 증가하는 경향을 나타내었다. 특히 ABA의 감소율과 zeatin의 증가율이 가장 크게 나타났다. 2. Osmoticum(mannitol)을 적정 농도 이상으로 처리하였을 때 ABA는 일시적으로 증가되었다가 감소되었고, 다른 성장 호르몬은 모두 증가폭이 농도가 증가될수록 둔화되었다. 3. Supermine 10mM과 NaCl을 처리하였을 때 담배와 벼에서 각 호르몬의 증감은 서로 반대로 나타났다. 특히 담배는 NaCl의 stress가 크게 나타났다. 그리고 배양 후반기에는 원형질체의 분열이 중지되었다. 4. 원형질체의 배지 성분을 제거하고 32℃ 로 고온 배양에 의해서 인위적으로 노화를 촉진시켰을 때 세포의 활력은 48시간 이후에 크게 감소되었다. 세포의 활력 상실과 반비례적으로 ABA는 배양 10일까지 크게 증가되었다. 이와 반대로 성장 호르몬들은 모두 증가되지 않고 감소가 이루어졌다. 특히 zeatin의 감소가 크게 나타났다. 5. 이상의 결과에 따라서 식물 호르몬은 원형질체가 처한 환경 요인이나 부여된 어떤 조건에 따라서 민감하게 변동하고 있음을 확인하였다.

식물원형질체를 이용하여 체세포잡종을 육성하기 기초자료를 얻고자 식물의 엽육부위, Callus에서 효과적인 원형질체의 분리, 적합한 배양조건 및 세포융합에 관한 조건을 조사한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 배양 융합조건에 적합한 식물원형질체의 분리 방법은 여러 종류의 효소농도에 따라 다르지만 담배 및 완두엽육 원형질체분리에는 Macerozyme 0.5%, Cellulase 2.0%, KDS 0.5%, Mannitol 0.7M의 효소용액에 처리시 활성 있는 원형질체를 얻을 수 있었다. 2. 배양중인 담배 및 대두의 Callus로부터 원형질체분리는 배양기간에 따라 세포활성도가 떨어지거나 쉽게 파괴되는 현상을 보여 양호한 원형질체를 얻을 수가 없었다. 3. 원형질체의 배양은 배양배지에 Plating할 경우 세포농도에 따라 차이가 있었으며 1.0 104 /ml이상이어야 분열이 가능하였고 배양조건은 150Lux 12시간 광암처리후가 세포분열 및 증식이 가장 왕성하였다. 4. 세포융합은 PEG농도가 중요하며 PEG 1500 0.33M에서 CaCl2농도가 높을수록 융합율이 증가되는 경향이었다.