Changes in contents of free sugars, amino acids, and fatty acids of legumes were analyzed for each phase of in vitro digestion. In addition, contents of resistant starch in raw and digested pulses were compared. Soybeans, kidney beans, cowpeas, and chickpeas were analyzed. An in vitro digestion model was used to analyze contents of nutrients using LC-MS and GC-MS. Stachyose in kidneybean, cowpea, and chickpea increased as the digestion phase progressed. In four types of legumes, raffinose slightly decreased or showed no significant difference between the Oral phase and the BBMV phase. Content of glucose, a monosaccharide, increased during the BBMV phase. During the digestion phase, levels of free amino acids and free fatty acids also increased. Content of resistant starch was reduced compared to that in the raw material. It was 0.01g/100 g food in soybean, 1.06 g/100 g food in red kidney bean, 0.77g/ 100g food in cowpea, and 0.76 g/100 g food in chickpea. It was confirmed that nutrients in the in vitro digestion model were liberated at each digestion phase with changes in the content of resistant starch. These results are expected to be used as fundamental data for obtaining bioavailability of nutrients.

Melamine has raised international concerns for its catastrophic health effects from tainted infant formula. This report concerns the developmental validation of a sensitive HPLC/MS/MS and GC/MS methods about melamine and cyanuric acid in human urine and serum. Analytical detection ranges of LC/MS was from 0.2 to 5.0 ng/mL and 2.0 to 60.0 ng/mL about melamine and cyanuric acid, respectively. The limits of quantification and confirmation are 0.2 ng/mL for both analytes in human urine and serum by LC/MS/MS. The range of recovery was 91.6%, and 107.6% for cyanuric acid and melamine in urine, respectively. The range of precision coefficient variation was from 2.0%, to 11.8% for cyanuric acid and melamine in urine. The range of recovery was from 94.9%, to 119.0% about cyanuric acid and melamine in serum, respectively. The range of precision coefficient variation from was 3.7%, and 13.5% about cyanuric acid and melamine in serum. Analytical detection ranges of GC/MS were 5.0 to 100.0 ng/mL about melamine and cyanuric acid, respectively. The limits of quantification and confirmation are 5.0 ng/mL for both analytes in human urine and serum by GC/MS. The range of recovery was from 83.7%, to 114.5% for cyanuric acid and melamine in urine, respectively. The range of precision coefficient variation was 3.5%, and 10.7% for cyanuric acid and melamine in urine. The range of recovery was 94.4%, and 110.7% for cyanuric acid and melamine in serum,respectively. The range of precision coefficient variation from was 3.9%, and 13.8% for cyanuric acid and melamine in serum. Several changes were taken to optimize performance by this method.

Metabolomics aims at the comprehensive, qualitative and quantitative analysis of wide arrays of endogenous metabolites in biological samples. It has shown particular promise in the area of toxicology and drug development, functional genomics, system biology and clinical diagnosis. In this study, analytical technique of MS instrument with high resolution mass measurement, such as time-of-flight (TOF) was validated for the purpose of investigation of amino acids, sugars and fatty acids. Rat urine and serum samples were extracted by selected each solvent (50% acetonitrile, 100% acetonitrile, acetone, methanol, water, ether) extraction method. We determined the optimized liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry (LC/TOFMS) system and selected appropriated columns, mobile phases, fragment energy and collision energy, which could search 17 metabolites. The spectral data collected from LC/TOFMS were tested by ANOVA. Obtained with the use of LC/TOFMS technique, our results indicated that (1) MS and MS/MS parameters were optimized and most abundant product ion of each metabolite were selected to be monitorized; (2) with design of experiment analysis, methanol yielded the optimal extraction efficiency. Therefore, the results of this study are expected to be useful in the endogenous metabolite fields according to validated SOP for endogenous amino acids, sugars and fatty acids.

This study was performed to confirm the microtubule assemblies and methylation patterns of porcine IVF and parthenogenetic embryos. Cumulus-oocyte complexes were collected and matured in vitro for 42 hr. Oocytes were fertilized by prepared fresh sperm or activated parthenogenetically by exposure to electric stimulation and 6-dimethylaminopurine. Porcine IVF and parthenogenetic embryos were cultured in vitro for 6 days. Embryos were stained by immunofluorescence staining method to observe the dynamic of nucleus and microtubules in the first mitotic phase and the methylation patterns in different developmental stages. After then, samples were confirmed and analyzed through a laser-scanning confocal microscope. IVF embryos had a centrosome originated from sperms, which was shown a ɤ-tubulin spot. However, ɤ-tubulin spot was not observed in parthenogenetic embryos. A lower methylation level was observed in IVF embryos compared to parthenogenetic ones at the morula and blastocyst stages. In conclusion, it is considered that microtubule assemblies and genetic regulation mechanism differ between parthenogenetic and IVF embryos.

본 연구는 물리적 탈핵 방법인 aspiration 방법과 squeezing 방법을 사용해 핵이식된 소 체세포 복제란의 발달능을 조사하였다. 두 방법에 의해 탈핵된 수핵란에 한우 귀피부 세포를 융합하여 체외에서 7～8일간 배양하여 발육능을 검사하였다. 배양 7일째 배반포 발달율은 aspiration 방법 (31.9±13.4%)과 squeezing 방법 (33.6±15.7%) 간에 차이가 없었다. 또한 배양 8일째 배반포 발달율도 squeezing 방법 (35.3±15.1%)과 aspiration 방법 (37.8±10.4%) 간에 차이가 없는 것으로 나타났다. 배양 7일째 배반포의 평균 세포수에 있어 각 처리 간에 차이가 없는 것으로 조사되었으며 (aspiration: 110.3±39.2, squeezing: 103.7±42.8), 세포자연사의 비율에 있어서도 역시 유의적인 차이가 없는 것으로 조사되었다 (aspiration: 2.8±2.6 %, squeezing: 4.3±4.4%). 본 연구의 결과는 물리적 탈핵 방법인 aspiration 방법과 squeezing 방법 모두 소 체세포 복제수정란의 생산을 위한 유용한 방법임을 보여준다.

본 연구의 목적은 요를 통해 hFSH를 발현하는 형질 전환 소의 생산이다. 요의 분비와 관련 있는 유전자로서 mUII promoter를 사용하여 hFSH유전자를 구성했다. 태아섬유아세포(KbFF)는 임신 45일령의 태아(male)에서 채취하였다. hFSH gene은 pcDNA3(neo) vector와 같이 KbFF 세포에 electroporation 방법으로 transfection하였다. 유전자를 transfection한 세포는 G-418로 2주 동안

본 연구는 활성화처리 방법 및 배양 조건이 돼지 단위발생란의 체외발달 및 apoptosis에 미치는 영향을 알아보기 위해 실시되었다. 도축장 유래 난소로부터 채취된 미성숙 난자를 42~44시간 동안 성숙배양한 후 사용하였다. Apoptosis는 TUNEL 방법을 사용하여 조사하였다. 실험 1에서는 성숙배양된 난자들을 electric pulse(1.2 kV/cm for 30μsec 2회, E), E + 6-dimethylaminopurine(6-DMAP) 또는 E + cycloheximide(CH) 방법으로 활성화 처리하여 PZM-3를 이용하여 5% CO2, 38.5℃에서 배양하였다. 실험 2에서는 전기자극을 이용하여 활성화처리된 난자들을 각각 PZM-3 또는 NCSU-23 배양액 내에서 배양하였다. 각 배양액 내의 난자들은 각각 20% O2 조건으로 나뉘어 배양하였다. E + 6-DMAP(36.5%) 또는 E + CH 구(32.5%)에서 E 구(27.7%)보다 유의적으로 높은 배반포 형성율을 보였다(P<0.05). 처리별 apoptosis 발생율은 각각 5.3%(E), 7.7%(6-DMAP) 및 7.1%(CH)였다. 실험 2에서는 PZM-3 구의 배반포 형성율이 NCSU-23 구에 비하여 산소분압조건과 관계없이 다소 높았다(28.2{sim}29.7% vs. 22.6~24.4%). PZM-3 및 20% O2 조건하에서 유의적으로 낮은 apoptosis 발생 비율을 나타냈다(9.2%, P<0.05). 그러므로 돼지 단위발생란을 chemical agent를 이용한 추가 활성화처리 후 PZM-3, 20% O2, 조건으로 배양하면 더 나은 배반포 발생율을 얻을 수 있다고 생각된다.

핵이식 방법을 이용하여 성공적인 복제를 이루기 위해서 인위적인 활성화 처리는 필수적인 요소이다. 본 연구는 전기자극에 의해 활성화된 난자를 chemical agent를 이용하여 추가적인 활성화 처리를 하였을 때 돼지 단위발생란의 발달에 미치는 영향을 알아보고자 수행되었다. 체외에서 40~44시간 동안 배양된 난자를 전기자극(E)으로 활성화 처리한 후 Thimerasol + Dithiothreitol(Thi+DTT), 6-Dimethylaminopurine(6-DMAP) 및 Cycloheximide(CH)를 사용하여 추가 활성화 처리를 하였다. 활성화 방법(E, E+Thi+DTT, E+6-DMAP 및 E+CH)에 따른 단위발생란의 배반포까지의 발달율을 조사한 결과, chemical agent에 의해 추가 활성화된 단위발생란이 전기자극만으로 처리된 구의 단위발생란보다 유의적으로 높은 발달율을 보였다(21.5~28.1% vs. 18.0%, P<0.05). 특히, E+Thi+DTT를 이용하였을 때 발달율이 유의적으로 높게 나타났다(28.1%, P<0.05). 활성화 처리별 전핵 형성율을 조사한 결과, chemical agent에 의해 추가 활성화 처리된 구에서 하나의 극체(1PN) 형성률은 처리별로 차이를 보이지 않았으나(59.9~64.7%), 2PN 형성율은 추가 활성화 처리구에서 전기자극만을 사용하였을 때보다 유의적으로 높게 나타났다(7.2~9.7% vs. 4.3%, P<0.05). 이상의 결과를 살펴볼 때, 전기자극 후 chemical agent를 이용한 추가 활성화는 단위발생란의 배반포까지의 발달능력을 증가시키는 것으로 생각된다.

본 연구는 돼지 동결-융해 정자의 배양에 의한 체외수정능력과 glycosidase activity를 평가하기 위하여 chlortetracycfine fluorescence분석법을 이용하여, glycosidase가 체외수정능력과 정자침입에 미치는 영향에 대하여 검토하였다. 또한 돼지난자의 투명대내에서 발견된 당잔기에 대한 정자의 glyco-sidase 특이성을 확인하기 위하여 α-L-fucosidase, α-D-mannosidase, β-D-galactosidase 및 N-acetyl-β-D-glucosaminidase (β-GlcNAc''''ase)의 activity를 분석하였다. 그 결과 glycosidase activity는 동결정자의 응해 후 배양하지 않았을 때보다 2시간 배양했을 때 더 높게 나타났다. β-GlcNAc''''ase의 activity 는 정자 배양 유무에 관계없이 다른 glycosidase 처리시보다 최소한 2배 이상 높게 나타났다. 또한 첨체반응이 유기된 정자의 비율은 glycosidase (α-D-mannosidase; P<0.05)에 의해 영향을 받았으며 자를 배양하지 않은 경우보다는 배양된 정자에서 높게 나타났다. 그러나 배양시간에 따른 정자의 존성에 대해 glycosidase의 종류에 따른 유의차는 인정되지 않았다. 한편 투명대내 정자의 접착과 입에 대한 또 다른 실험에서, 서로 다른 glyco-sidase가 첨가된 배양액내에서 수정된 정자가 배양시간이 길어짐에 따라 정자의 침입율은 낮아졌다 β-GlcNAc''''ase; P<0.05). 투명대내의 정자접착정도는 glycosidase의 첨가시에 무첨가시보다 접착정도가 더 높았으며, 가장 높은 접착율은 β-GlcNAc''''ase 첨가시 나타났다. 또한 모든 glycosidase 처리시 2시간 배양한 정자보다는 배양하지 않은 정자에서 투명대에 대한 접착정도가 높게 나타났으며, α-D-mannosidase의 처리시 유의적인 차이를 보였다 (P<0.05). 본 연구의 결과, β-GlcNAc''''ase가 주로 돼지정자의 원형질막내에 존재하는 것으로 추측되며, 배양된 정자에 의한 투명대 접착정도와 침입율이 낮았음에도 불구하고 glycosidase activity가 증가하는 것으로 나타났다.