In this study, we investigated the possibility of using mouse embryonic stem cell conditioned medium (ESCM) and embryonic stem cell medium (ESM) for in vitro maturation in the efficient in vitro production of blastocysts from porcine follicular oocyte. Depending on the concentration of supplement of ESCM added to the NCSU-23 solution did not affect 2-cell development rates and blastocysts development. However, in particular, the survival rate (10 days of culture) of blastocyst was significantly higher than that of the control group as the additive concentration (30%) increased (p < 0.05). The survival rate of blastocysts showed a similar tendency even with addition of ESM (30%) alone. On the other hand, the duration of the addition of these additives during IVM (0-44 h) was that the IVM I period (0-22 h) were more effective than the IVM II period (22-44 h). Thus, the effect of these additives is probably due to the combination of the various physiologically active substances of ESCM or the appropriate amino acids and vitamins of ESM. In particular, these additives were more effective during the first half (IVM I) of in vitro maturation. In summary, optimization of ESCM or ESM supplementation may improve in vitro maturation of porcine oocyte and affect developmental competency. Therefore, if more efficient methods of adding ESCM or ESM to basal culture medium can be developed during in vitro maturation of porcine follicle oocytes, high quality blastocysts will be developed from low porcine follicular oocyte compared to other domestic animals.

PKC는 그들의 cofactor-requirments에 따라 cPKC, nPKC 그리고 aPKC, 3그룹으로 나어진다. 마우스 난 성숙과정에 있어서 cPKC 및 nPKC의 activators인 PMA의 영향에 대한 많은 결과가 보고되었다. 그러나 각각의 그룹에 대한 차별화된 영향에 대하여는 밝혀져 있지 않다. Mezerein의 analog인 thymeleatoxin은 cPKC의 특이적인 activator로 보고되어져 있다. 본 연구에서는 specific cPKC activator인 thymeleatoxin의 마우스 난 성숙과정에의 영향을 제1감수분열 재개 능(germinal vesicle break down, GVBD)과 제1 극체 형성 능(1st polar body extrusion)을 조사하여 cPKC및 nPKC activator인 PMA와 비교 검토하였다. 그 결과 GVBD IC50는 thymeleatoxin에서 ～400nM, PMA에서는 ～50nM이었으며, 제1극체 방출의 IC50는 thymeleatoxin에서 ～200nM, PMA에서는 ～20nM이었다. 이들 결과는 Thymeleatoxin의 GVBD나 1st polar body extrusion 저해효과가 PMA에 비하여 1/8～1/10인 것으로 나타났다. 이들 결과는 GVBD나 제1극체 형성을 포함하는 난 성숙과정에서 cPKC보다 상대적으로 nPKC의 관여가 깊음을 보여 준다.

SUMMARY I. 서 론 II. 재료 및 방법 III. 결 과 IV. 고 찰 V. 적 요 VI. 인용문헌

암컷 Aedes aegypti의 난성숙과장에서 새로 나타나는 malate dehydrogenase(L-malate, oxidoreductase, EC 1.11.37, MDH)를 DEAE-Sepharose, Sulphonyl-Sepharose, Cibacron 3FGA affinity chromatography를 이용하여 분리정제하여 그 특성을 조사하였다. 분자량은 70,000 dalton정도의 dimer 형태로 되어 있으며 최적 pH는 malate-oxaloacetate반응에서는 pH 9.0~9.2, oxaloacetate-malate 반응에서는 pH 9.8~10.2이었다. 정재된 MDH는 mitochondria에 위치하고 있으며 기질로서 malate에 대한 Km값의 경우 M, oxaloacetate에 대한 Km 값은 M, NAD에 대한 Km값은 M이며 NADH에 대한 Km 값은 M 을 보이고 있으며 각각의 기질에 의한 저해현상을 보이고 있었다. 기질에 대한 Km값을 부분적으로 분리한 DEAE-sepharose에 흡착된 원형질 MDH와 비교한 결과 malate에 대한 Km 이 으로 상당한 차이를 보이고 있었다. 또한 정제된 MDH는 cltrate, -ketoglutarate, ATP 등의 대사산물에 의하여 저해작용을 받았다. ATP 및 citrate에 의한 MDH 활성도 저해는 oxaloacetate-malate반응에서 보다는 malate-oxaloacetate 반응에서 덜 일어났다. Oxaloacetate-malate 반응의 경우 ATP에 의하여저해작용이 완전히 일어났으며 malate-oxaloacetate반응에서는 cltrate에 의하여 저해작용이 일어나지 않았다. 흡혈 후 생성되는 MDH는 난소에서 합성되며 흡혈 수 난소에서 18시간 때부터 활성도가 나타나 48시간 이후 최고 활성도가 유지되는데 TCA회로의 isocitrate dehydrogenase 의 경우 난소내에서의 활성도 변화가 MDH의 변화 양상과 같았다.

연두금파리의 난세포성숙에 따른 단백질의 변화와 난특이성단백질의 특성을 확인하기 위하여 gel filtration, 전기영동 및 분자량측정, 아미노산과 지방산함량을 측정하여 얻은 결과는 다음과같다. 연두금파리 암컷성충의 난소단백질은 단백질원을 섭식시킨 후 72시간 이후 빠르게 증가하였고, 완전한 성숙이 일어나는 96시간에 최고의 함량을 나타냈다. DEAE-cellulose와 Sephacryl 5-200으로 gel filtration하고 7.5% native polyacrylamide gel에서 전기영동한 결과 난소에서 분리된 특이단백질은 0.4에서 혈림프 및 난소와 다른 밴드가 확인되었으며, 분자량은 110,000 dalton이였다. 분리된 난특이성단백질내 아미노산 조성은 asparagine 외 모두 13종이 검출되었으며, asparagine, glutamic acid와 함께 tyrosine이 특이하게 높게 나타났다. 지방산은 난소와 함께 난특이성단백질에서 palmitic acid의 4종이 분리되었다. 따라서, 연두금파리의 난에는 지방체에서 합성, 분비된 난황단백질이외에 난소에만 존재하는 특이단백질이 있음을 알 수 있다.

검정금파리의 변태에 따른 엑디스테로이드를 Radioimmunoassay법으로 측정하고, 난세포성숙에 미치는 엑디스테로이드의 효과를 조사하여 얻을 결과는 다음과 같다. 산락직후 존재하였던 난내 엑디스테로이드는 발생과정 중 감소하다가 부화 직전 다시 증가하였으며, 유충기와 용기의 성장 변태시 엑디스테로이드함량의 변화를 보면 유충-유충과 유충-용으로의 탈피시에 일시적인 증가현상을 나타냈다. 특히 용화 후 48시간에 높은 엑디스테로이드의 농도를 보였는데 이는 큐티클분비와 경화작용과 밀접한 관계가 있는 것으로 생각된다. 성충기에서는 수컷의 경우 엑디스테로이드가 거의 검출 되지 않은 반면, 암컷에서는 단백질원 섭식 후 96시간에 최고의 함량을 나타내어 난성숙도와 일치하는 변화를 보였다. 엑디스테로이드 처리와 난성숙도와의 관계를 보면, 1g 처리군은 대조군에서와 같은 성숙도를 나타내 차이를 보이지 않았으나, 5g처리군에서는 대조군에서 보다 12시간 빠르게 난세포성숙이 완료되어, 엑디스테로이드 처리시 임계농도 이상에서는 난세포조기성숙에 직접적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.

국내 유용 양식품종인 새꼬막, Scapharca subcrenata은 돌조개 목 (Order Arcoida) 돌조개 과 (Family Arcidae)에 속하는 종으로써, 같은 과에 속하는 꼬막, Tegillarca granosa과 피조개, Scapharca broughtonii의 중간크기이다 (Kwon et al., 2001). 새꼬막이 국내 연 총생산량은 많게는 3,000 톤 가까이 되지만, 종패의 수급에 있어 주로 자연채묘에 의존하고 있기 때문에 지속적이고 양호한 채묘율을 기대할 수 있다. 새꼬막에 관련된 연구는 수온과 염분 등 환경요인에 의한 영향 (Nakamura, 2005; Shi et al., 2007; Fang et al., 2008), 생식주기 (Kim et al., 2008), 유생분포 (Kim et al., 2006), 채묘와 성장 (Lim and Hur, 2010) 등 그 보고되고 있지만, 꼬막에 비해 많지 않으며, 특히 국내의 경우 인공성숙 등에 관한 연구는 찾아보기 힘들다. 따라서 본 연구는 새꼬막의 성패를 이용하여 성 성숙에 있어 가장 중요한 요인 중 하나인 수온 상승만으로도 생식소의 발달 및 정상적인 난 발생이 진행되는지 파악하고자 하였다. 연구에 사용된 새꼬막의 크기는 각장 31.81±2.21 ㎜, 전중 9.87±1.94 g이었으며, 전라남도 고흥군의 여자만에서 채집하였다. 사육기간은 28일 간이었으며, 대조구는 일반수온으로 설정하였고, 가온구는 매일 0.5℃씩 수온을 상승시킨 후 20℃가 되는 시점에서 일주일간 수온을 유지하였다. 먹이는 Isochrysis galbana, Chactoceros calcitrans, Tetraselmis tetrathele 3종의 미세조류를 혼합하여 1 ton 수조에 3시간마다 200ℓ (5,000～6,000 cells/㎖)씩 자동급이장치에 의해 공급하였다. 매일 사망개체를 파악하여 생존율을 조사하였으며, 7일 간격으로 채집하여 성비, 생식소발달 및 생식소지수를 분석하였다. 또한, 가온성숙된 개체들을 대상으로 간출자극에 의한 산란유발을 실시한 후 정상적인 난발생이 이루어지는지 관찰하였다. 연구 종료 후 관찰된 새꼬막의 생존율은 대조구에 비해 낮은 생존율을 보이고 있었다. 성비는 암:수의 비가 대조구는 1:0.97로 별다른 차이를 보이지 않았지만, 가온구는 1:0.62로 암컷이 높게 나타났다. 비만도는 대조구와 가온구가 유의한 차이를 보이는 가운데 수온 17℃ 이상부터 증가폭이 높게 나타났다. 생식소발달빈도는 암․수 모두 대조구의 경우 발달이 느렸으며, 가온구는 수온 20℃인 사육 21일부터 28일 사이에 성숙기에 도달한 개체들이 80% 이상 관찰되었다. 생식소지수는 대조구에 비해 수온이 높을수록 증가하는 경향을 보였다. 수온 26℃ (32‰)에서 새꼬막의 수정란 크기는 직경 63.17±1.22 ㎛였으며, 수정률은 82.17±3.55%였다. 부화율은 63.57±2.36%였다. D형 유생의 발생소요시간은 수정 후 약 15시간으로 나타났으며, 크기는 각장 82.85±0.87 ㎛, 각고 72.65±1.07 ㎛였다.

Differential display-PCR 방법을 이용하여, hCG 처리에 의한 참돔, Pagrus major의 난성숙 능력의 획득 경과시간에 따라 새롭게 발현하는 cDNA를 해석하였다. Differential display-PCR과 5'RACE 방법을 이용하여, 2,662 염기와 434개의 아미노산을 코드하고 있는 cDNA의 전염기배열을 결정하였다. DNA의 데 이터베이스인 GenBank 및 EMBL을 이용하여 상동성을 검색한 결과, 본 cDNA와