Human growth hormone (hGH), one of the most important hormones in medicine, is secreted from anterior pituitary gland. Its broad physiological function includes body growth, cell regeneration, increasement of muscle volume, bone density, body fat reduction, and so on. Due to the wide range of therapeutic effects, the hGH produced from E. coli has been commercialized already. In this study, we asked whether it is possible to produce recombinant hGH efficiently from various cultured mammalian cells. To meet this purpose, we chose a retrovirus vector system for transfer and expression of the hGH gene in various mammalian cells. Analyses of RT-PCR, ELISA, and Western blot to determine expression of the hGH gene showed the highest production of the hGH was determined from chicken embronic fibroblast (CEF) cells with the concentration of 8.58 μg/ml. The biological activity of the hGH was similar to the commercially available counterpart. These results suggest that mass production of hGH is possible not only in the E. coli but also in the various mammalian cells.

hFSH is a glycoprotein secreted from anterior pituitary and consists of α and β subunits. Because of its major biological functions including sperm formation in the male and for follicular growth, FSH is used to cure woman's sterility. In this study we tried to produce recombinant hFSH in vitro using a retrovirus expression vector. Two major components of the vector we constructed are: (ⅰ) a DNA fragment containing α and β genes fused by a DNA sequence coding carboxyl terminal peptide (CTP) of human chorionic gonadotropin, (ⅱ) a DNA fragment corresponding woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE). Evaluation of expression profile of the recombinant FSH using reverse transcription PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Among three cell lines tested, HeLa cells were the best for hFSH expression (5,395 mIU/ml), then followed by chicken embryonic fibroblast (CEF) cells and Chinese hamster ovary (CHO) cells in the order of hFSH production. In addition to the amount, the FSH produced from HeLa cells was highest in terms of biological activity which was determined by measuring cAMP.

본 연구에서는 외래 유전자의 지속적인 발현에 의한 형질 전환 개체나 세포의 생리적인 부작용을 최소화하기 위하여 hTPO 유전자의 발현을 조절할 수 있는 tetracycline-inducible retrovirus vector system을 구축하고자 하였다. hTPO 유전자는 사람의 간암세포인 HepG2에서 분리한 RNA를 주형으로 하여 RT-PCR 방법을 이용하여 확보하였으며, 이 유전자를 MLV 유래의 vector에 도입하여 pLNChTPOW를 재조합하였다. 재조합한 vector는 GP2 293 포장세포에 도입하여 바이러스를 생산하였으며, 이 바이러스를 이용하여 감염시킨 여러 표적세포에서 hTPO의 발현을 확인하였다. 또한, hTPO의 발현을 유도적으로 조절할 수 있도록 하기 위하여 hTPO를 one vector 형태의 Tet-On vector system에 도입하였으며, 발현의 유도 조건에서 보다 강한 발현을 위하여 WPRE 서열을 여러 위치에 도입하였다. 구축한 Tet system의 발현 조절 정도는 각 바이러스를 감염시켜서 구축한 CEF와 PFF 세포에서 RT-PCR과 Western blot, 그리고 ELISA 방법을 이용하여 확인하였다. 그 결과, CEF에서는 WPRE 서열이 hTPO 유전자의 3'에 위치한 경우에서, PFF에서는 WPRE가 rtTA의 3'에 위치한 경우의 vector system에서 가장 높은 발현율과 유도율을 나타내었다. 이는 Tet system에서의 hTPO 유전자 발현 조절이 매우 효율적으로 이루어지며, 세포주에 따른 의존적인 조절 양상을 보이는 것을 의미한다. 따라서 hTPO의 대량 생산을 위한 생체 반응기로서의 형질 전환 동물의 개발을 보다 효율적으로 수행하려면 적절한 Tet system이 선별적으로 적용되어야 할 것이다.

본 연구에서는 인간 부갑상선 호르몬의 발현을 유도적으로 조절할 수 있는 retrovirus vector system을 확립하고자 하였다. 이에 tetracycline계 물질로 발현을 유도적으로 조절할 수 있는 one vector 형태의 Tet-On system을 이용하였으며 WPRE 서열을 도입하여 유도적 조건에서 외래 유전자의 발현을 증가시켰다. 구축한 각각의 표적세포에서 RT-PCR과 ELISA를 이용하여 hPTH 유전자의 발현 정도를 비교 측정한 결과, WPRE가 hPTH의 3' 위치에 도입된 RevTRE-PTH- WPRE-CMVp-rtTA2SM2 virus를 이용하여 유전자를 전이시킨 경우에 hPTH의 발현량이 가장 높은 것으로 나타났고, 또한 유도율도 가장 큰 것으로 확인되었다. 이 system을 이용하여 생산한 고감염가의 virus는 인간의 부갑상선 호르몬을 생산하기 위한 동물세포주의 구축이나 형질전환 동물의 생산에 있어서 매우 효율적인 유전자 전이 수단이 될 것으로 사료된다.

본 연구에서는 retrovirus를 이용한 유전자 전이에 있어서 대두되는 큰 문제점의 하나인 외래 유전자의 지속적인 발현으로 인한 개체의 생리적인 손상을 최소화하기 위하여 tetracycline계 물질의 공급 여부에 따라서 발현을 유도적으로 조절할 수 있는 one vector 형태의 Tet-On system을 구축하고자 하였다. 또한 WPRE 서열을 이 vector 상에 도입하여 유도적 조건에서 외래 유전자의 발현이 보다 강하게 일어날 수 있는 효율적인 retrovirus vector system을 확립하고자 하였다. 구축한 각각의 vector system에서 fluorometry와 western blotting을 이용하여 GFP 유전자의 발현 정도를 비교 측정한 결과, RevTRE-EGFP-WPRE-RSVp-rtTA2SM2 virus를 이용하여 유전자를 전이시킨 표적세포에서 GFP의 절대적인 발현량이 가장 큰 것으로 나타났고, 유전자 발현의 turn on/off에 의한 유도율은 RevTRE-EGFP-RSVp-rtTA2SM2-WPRE virus의 경우에서 8∼21배로 가장 높은 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 외래 유전자의 발현을 효율적으로 조절할 수 있는 vector system은 WPRE가 rtTA2SM2 서열의 3에 위치한 형태로, 이 system을 이용하여 생산한 고감염가의 virus는 유전자 치료나 형질전환 동물의 생산에 있어서 요구되는 외래 유전자의 발현을 효율적으로 조절할 수 있는 수단이 될 것이다.

골다공증 치료제로 이용되고 있는 hPTH는 체내의 혈중 칼슘 농도를 조절하는 인간의 부갑상선 호르몬이다. 본 연구에서는 hPTH를 효율적으로 생산하는 돼지세포를 구축하고자 다양한 retrovirus vector를 이용하였는데 다음과 같은 결과를 관찰하였다. 1) hPTH 유전자의 전이를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행한 결과, 형질전환된 모든 돼지세포에서 420 bp의 hPTH에 해당하는 단편을 확인할 수 있었으며, WPRE가 도입되지 않은 실험군보다 WPRE서열이 도입된 실험군에서 더 강한 밴드를 확인하였다. 2) ECLIA 측정 결과 hPTH 유전자가 도입된 모든 세포에서 hPTH가 생성되었으며, 특히 Tet-On system에서는 doxycycline을 처리한 실험군에서 hPTH의 발현이 유도되었음을 확인하였다. 또한 RT-PCR과 ECLIA을 수행하여 hPTH의 도입 여부와 단백질 생산을 비교한 결과, WPRE 서열이 hPTH 유전자의 downstream 위치에 도입된 실험군에서 가장 많은 단백질이 생산됨을 확인할 수 있었다.

모유에 존재하는 유지방구의 막을 구성하는 주된 당단백질인 하나인 lactadherin(과거에는 BA46로 일컬어짐)은 rotavirus에 의한 감염증상을 예방하는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 retrovirus vector system을 이용하여 Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포에 tetracycline에 의해 발현이 제어되는 promoter 하의 lactadherin 유전자를 전이 시킨 후 lactadherin이 tetracycline에 의해 발현이 유도되는지의 여부를 실험하였다. 먼저 기초 실험으로 대장균의 LacZ 유전자를 이용하여 tetracycline에 의한 유도 여부를 시험하였다. RevTet-On과 RevTRE-LacZ retrovirus를 동시감염시킨 NIH3T3는 doxycycline (tetracycline 유도체)에 의해 투여량에 비례하여 반응정도가 증가하는 양상을 나타내었으며 최대의 반응은 doxycycline 농도가 1 ㎍/ml 이상에서부터 관찰되었다. 이 예비실험의 결과를 바탕으로 RevTet-On과 RevTRE-Ltd retrovirus vectyor를 이용하여 사람의 lactadherin 유전자의 유도적 발현을 검정하였는데 CHO 세포에서 lactadherin 유전자의 유도적 발현을 RT-PCR 기법을 이용하여 확인하였다. 표적세포 내에서 외부에서 도입된 유전자가 지속적으로 발현될 경우 심각한 생리적 부작용을 야기시킨다는 사실을 감안할 때 본 실험의 결과는 유전자 치료와 형질전환동물의 생산에 크게 도움이 될 것으로 예상된다.

hFSH는 α와 β subunit으로 구성된 heterodimer로서 두 subunit의 조합은 활성을 지닌 호르몬의 생산에 있어서 매우 중요한 단계이다. 이 조합과정의 효율을 증대하기 위하여 본 연구에서는 hFSH를 단일사슬의 단백질로 구축하고자 하였으며, 이의 일환으로 각 subunit 대한 cDNA단편을 연결하는 서열로 CTP linker를 도입하였다. 재조합한 hFSH-CTP 유전자는 pseudotype의 retrovirus vector system을 이용하여 CHO 세포와 닭의 배로 각각 전이되었다. CHO 세포에서의 FSH의 생산은 α와 β를 각각 전이한 경우에 비해 hFSH-CTP를 전이한 경우에서 17배 이상 높은 것으로 나타났다. 닭에서는 유전자 전이를 시도한 62개체 중에서 11마리가 부화하였으며 그 중 10마리가 형질전환된 닭인 것으로 RT-PCR을 통하여 확인되었다. 그러나 개체의 혈중 FSH의 생산은 확인하지 못하였다. 이상의 실험 결과를 바탕으로 하여 재조합된 hFSH-CTP는 FSH의 발현에 매우 효율적인 구조로 생각되며, 또한 retrovirus를 이용한 유전자 전이 방법은 형질전환 가금의 생산에 있어서 매우 적절한 방법으로 사료된다.

형질전환 동물은 질병의 모델, 유전자 기능 및 조절에 관한 연구, 또는 독성물질을 탐색하는 연구 수단 등과 같은 기초 연구 분야뿐만 아니라 인체에 유용한 단백질의약품의 생산과 간, 신장 등 특정 장기의 공급원 등과 같은 임상적인 분야에서도 활용가치가 매우 크다. 이 중 형질전환 동물을 이용한 치료용 단백질의 생산은 비교적 낮은 생산 원가와, 분리와 정제의 용이성, 그리고 효율적인 대량 생산 체계의 확립 등의 장점을 가진다. 형질전환동물을 바이오의약품 생산수단으로 사용하고자 하는 발명에는 젖, 소변 또는 혈액을 통하여 백혈구증식인자, 조혈인자, 항체 등 고가의 생물의 약품을 배출시키는 소, 돼지, 흑염소 등이 등록되어 있다. 이 방법은 기존의 세포배양 방법보다 생산비용이 훨씬 저렴하고 부가가치도 높아 새로운 의약품 생산수단으로 주목받고 있다. 그러나 현재까지 방대한 시간과 비용이 투자되었음에도 불구하고 형질전환 가축을 이용한 바이오 의약품의 경제적인 성공사례는 매우 미미하며, 그 근본 원인은 대부분 포유류들의 긴 세대 간격, 천문학적인 비용과 많은 시간, 그리고 외래 단백질이 체내에서 과잉 발현됨으로 인해 발생하는 형질전환동물의 생리적인 부작용에 있다고 요약할 수 있다. 생체반응기로서 가금이 포유동물에 비해 갖는 장점은 첫째, 성성숙기간과 세대간격이 짧으며, 둘째, 포유류에 비해 번식능력이 대단히 높기 때문에(연간 300개 이상의 계란을 생산) 형질전환된 가금의 계통성립이 용이하고, 셋째, 비교적 적은 노력과 비용으로 많은 개체를 대상으로 하는 실험이 가능하다는데 있다. 또한 각 계란의 난백에는 총 3 g 정도의 단백질 성분이 있으며 단백질의 종류는 8가지 뿐이다. 따라서 형질전환 포유동물의 젖에 비하여 형질전환 닭의 계란에 함유된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 것이 훨씬 용이하다. 예를 들면, 현재 난백으로부터 특정 단백질을 분리하는 비용이 g당 10달러 정도로 추산되는데, 이는 세포배양액으로부터 특정 단백질을 분리하는 비용의 1%에 불과하다. 따라서 형질전환 닭의 생산은 기초적인 연구로서도 중요할 뿐만 아니라 계란을 이용한 치료용 단백질의 대량 생산에 있어서도 그 의미가 크다. 닭은 번식생리학적으로 포유동물과 매우 달라 기존의 포유동물 형질전환 방법을 동일하게 적용할 수는 없으며, 형태적, 발생학적 차이점을 고려하여 발전된 형질전환 닭의 생산방법에는 유전자를 전달받는 표적세포와 유전자전이 방법에 따라 다양한 방법이 이용되고 있다. 형질전환 닭의 생산을 위한 표적세포로는 stage X의 배반엽세포(갓 산란된 유정란의 배를 구성하는 세포), 원시생식세포(primordial germ cell), 닭의 난관에서 채집한 1세포기의 수정란 그리고 정자 등이 있다. 표적세포에 대한 유전자 전이 방법에는 물리화학적 DNA 전이 방법과 retrovirus (lentivirus) vector system을 이용한 방법으로 크게 나눌 수 있다. 각각의 방법은 외래 유전자의 전이 효율이나 다음 세대로의 전달 여부, 그리고 기술적인 용이성에서 조금씩의 차이를 나타내는데, 이 중 다음 세대로의 유전자 전달이 잘 이루어지고 기술적인 용이성이 높은 관계로 현재 가장 널리 사용되고 있는 방법은 배반엽세포 및 원시생식세포를 표적세포로 virus vector system을 이용하여 유전자를 전이하는 방법이다. 기존의 다른 유전자 전이 체계와 비교해 볼 때, 레트로바이러스를 이용한 유전자 전이는 기술적인 용이성과 효율적인 발현, 그리고 전달된 유전자의 유전적인 안정성 등의 장점을 나타낸다. 기존의 retrovirus vector에서는 주로 LTR이나 β-actin, CMV promoter 등과 같은 constitutive promoter를 이용한 외래 유전자의 발현은 개체 전체에 걸쳐 광범위하게 이루어지므로 형질전환 동물의 생리적인 부작용을 나타내는 경우가 많았다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 외래 유전자의 발현으로 인한 생리적인 부작용을 최소화하면서 또한 특정 조직에 국한하여 일어날 수 있도록 조직 특이적 발현 promoter와 유전자의 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 promoter 등을 개발하기 위한 노력이 시급한 실정이다. 예를 들면, 닭의 난관에서 특이적으로 발현하는 ovalbumin promoter와 tetracycline inducible promoter 등이 그것이다. 또한, 필요한 경우에는 동물체에 도입된 외래 유전자의 발현을 최대화하기 위하여 WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)와 같은 서열도 도입되어야 할 것이다. 본 연구자들은 retrovirus vector system을 이용하여 닭의 배반엽세포에 외래유전자를 전이하는 방법으로 형질전환 닭을 생산하는 연구를 진행하고 있으며, 선행된 연구 결과에 의하면 전이된 외부 유전자가 닭의 genome 상에 삽입되어 발현되는 것을 생산된 모든 병아리에서 확인할 수 있었다. 따라서 생체반응기로서 일반 포유류가축 대신 닭을 사용하는 것이 앞에서 언급한 시간적, 경제적 장점 외에 형질전환개체의 생산 측면에서의 성공 가능성이 훨씬 높다고 단언할 수 있다. 본 연구자는 외래 유전자의 발현율을 증가시키기 위하여 retrovirus vector에 WPRE 서열을 도입하였으며, 외래 유전자의 과잉 발현에 의한 개체의 생리적인 부작용을 최소화하기 위하여 외래 유전자의 발현에 대한 개시 및 종료가 조절 가능한 tetracycline inducible expression system을 도입하여 형질전환 닭을 생산하였다. 현재까지 형질전환 닭으로부터 발현을 시도한 재조합 단백질로는 단일클론항체, FSH, EPO, G-CSF 그리고 interferon 등이 있으며, 이들 단백질이 산란된 계란의 흰자에 분비되도록 하는 기술을 개발하여 실용화하려는 시도를 하고 있다. 그러나 현재까지 개발된 형질전환 닭의 생산에 있어서 매우 만족할 만한 성공적인 사례는 거의 전무한 실정이며, 이에 생체반응기로서의 형질전환 닭의 생산에 관한 연구가 적극적으로 진행되어야 할 것으로 생각된다.