Characteristics of induced pluripotent stem (iPS) cells are consistent with those of embryonic stem (ES) cells. However, exogenous genes integrated by using retrovirus delivery systems cannot be completely removed from the cells. In a recent report, activation-induced cytosine deaminase (AID) and thymine DNA glycosylase (TDG) can induce pluripotency state in mouse differentiated cells through the process of DNA demethylation. Thus, we hypothesized that the two reprogramming factors may convert efficiently bovine differentiated cells into pluripotency state. So, genes of AID and TDG were integrated into pCMV6-AC-IRES-GFP-Puro expression vector, which was transfected into bovine differentiated cells. As results, the colonies derived from AID+TDG-induced bovine cells were formed on day 7 after culture. The number of AP positively colonies in AID+TDG-induced bovine cells was significantly higher than in AID-induced bovine cells (p<0.05). Additionally, expression of pluripotent genes (OCT-3/4, NANOG, SOX2) was slightly increased in AID+TDG-induced bovine cells, as compared to AID-induced bovine cells. Protein expressions of OCT-3/4, NANOG and SOX2 in AID+TDG-induced bovine cells were slightly increased rather than AID-induced bovine cells. Finally, DNA demethylation in the promoter regions of pluripotent markers in AID+TDG-induced bovine cells was increased than that of AID-induced bovine cells. In conclusion, pluripotent stem cells could be efficiently produced from bovine differentiated cells by using non-integrating delivery system with the reprogramming factors (AID and TDG).

체세포 복제기술을 이용한 복제가축 생산 기술은 1997년 전 세계적으로 이슈가 되었던 복제 면양 “Dolly”의 탄생을 계기로 여러 나라에서 소, 돼지, 말, 고양이, 개 등 많은 포유류에서 산자 생산에 성 공하였으며 우리나라의 체세포 복제 기술은 기술 선진국 대열에 들어서고 있다. 그러나 복제기술은 아 직까지 높은 유산율과 폐사율 등 해결해야 할 많은 근본적인 문제점 등이 있어 연구해야 할 분야는 적 지 않다고 하겠다. 체세포 복제 동물 생산기술은 당초에는 능력이 우량가축의 생산과 확대 및 조기증식 을 목적으로 이용되고 왔으나, 체세포 내로 우리가 원하는 유전자를 도입시키거나 없애는 기술 (knock-in과 knock-out)의 발달로 바이오장기 생산용 형질전환 복제 돼지의 생산을 목적으로 널리 이 용되고 있다. 또한, 최근에는 멸종위기에 있는 희소동물 유전자원을 멸실 이전에 동결 보존된 체세포를 이용하여 복원에 활용할 뿐 아니라 마약탐지견 생산 등 특수한 목적으로 활용되는 동물을 생산하는 기 술로서 기여하게 된다면 산업적으로 활용할 수 있는 분야가 더욱 확대될 것으로 기대된다. 따라서 체세 포 복제기술은 식용보다는 오히려 다양한 목적으로 복제동물을 생산하게 되면 산업적으로 활용할 수 있 는 가능성이 높을 것으로 기대되고 있다.

핵이식(NT) 기술을 이용하여 여러 동물 종에서 성공적으로 복제산자가 보고되고 있지만, 아직까지 비효율적인 기술로 남아있다. 본 연구에서는 돼지 체세포 복제 생산 효율성을 증진시키기 위한 방안으로 수핵난자의 품질에 초점을 맞추어 Brilliant cresyl blue (BCB) 염색을 통하여 발육능이 우수한 미성숙 난자를 선발하고, 난자의 감수분열 재개에 관여하는 단백질 합성을 비특이적으로 억제하는 cycloheximide (CHXM)을 이용하여 돼지 난자의 감수분열 재개를 억제시켜 난자의 성숙 동기화를 유도하였다. 또한 핵초기화에 밀접한 영향을 주는 핵막붕괴(NEBD)와 조기염색체응축 (PCC)을 유도하는 MPF의 활성화를 높이기 위하여 단백질 phosphatase 억제제인 caffeine을 첨가하여 수핵난자의 품질을 향상시키고자 하였다. 실험 방법으로는 13 mM BCB 첨가된 배양액에 90분 동안 미성숙난자를 배양하여 BCB 용액의 착색 여부를 구분하여 선발하고, 5 ㎍/ml CHXM를 체외 성숙액에 첨가하여 난자성숙 동기화를 유도하였다. 또한 탈핵 후 탈핵난자를 caffeine을 처리하여 세포주기 관련 단백질의 활성화를 인위적으로 조절하여 체세포복제 수핵난자로 사용하였다. 실험 결과로서 BCB 염색 돼지 미성숙 난자를 대조구와 비교할 때 제2 감수분열 중기(MII)에 도달하는 체외성숙율과 단위발생란의 배반포기까지의 체외 발육율이 유의적으로 증가하는 것이 관찰되었다. 또한 미성숙 돼지 난자의 초기 성숙 (12∼16시간)에 CHXM를 처리하였더니 난자 감수분열 재개가 억제되어 GV기에 핵 성숙이 정지되어 동기화가 유도되었다. GV기에 세포주기 동기화된 난자들은 CHXM를 제거하였을 때 난자 성숙의 진행속도도 일치하는 것이 관찰되었다. 이런 결과는 가장 적합한 탈핵시기인 제1 감수분열 후/말기(AI/TI)에 난자들이 다수 분포하여 대조구에 비하여 높은 탈핵율 (87.9%)을 얻을 수 있었다 (P < 0.05). 덧붙여 5 mM의 caffeine을 돼지 난자에 12시간 처리하였을 때 난자 MPF의 활성화가 증가하는 것이 관찰되었지만 (P < 0.05), 10 mM caffeine 농도를 처리하였을 때 MPF의 활성화가 오히려 감소되어 단위발생란의 배반포기까지의 체외발육에도 악영향을 주는 것이 관찰되었다.

본 연구는 공여 세포의 종류, 수핵 난자의 유래 및 수란 산양 발정 동기화 조건이 복제 산양 생산에 미치는 영향을 알아보고자 실시되었다. 공여 세포는 귀 유래 섬유아세포를 분리 배양하여 사용하였으며, 체내 성숙 난자는 성숙한 미경산 재래 산양에 과배란을 유기하여 외과적인 방법으로 난관 관류를 통해 회수하였으며, 배란이 되지 않은 난포란은 난포로부터 흡입 채취한 후, 22시간 동안 체외 성숙을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 zona drilling 후,

본 연구는 재래산양에서 복제 수정란의 생산효율을 향상시키기 위한 기초 자료를 제시하고자 체세포 핵이식을 실시하여 공핵세포의 종류, 핵이식란의 활성화 처리 방법 및 수핵난자의 조건이 체외발달율에 미치는 영향을 조사, 검토하여 핵이식란 생산을 위한 최적의 조건을 규명하고자 실시하였다. 공핵세포의 종류에 따른 핵이식란의 체외발달율은 융합이 이루어진 핵이식란의 활성화 처리 후 분할율은 귀 유래 섬유아세포를 공핵세포로 사용하였을 때가 로서 태아 유래 섬유아세포를

본 연구는 동물복제 및 형질전환 동물생산 등의 연구에 기초자료를 제공하고자 재래산양의 oocyte를 단위발생을 유도하여 회수난자의 조건, 활성화방법, 배양조건 등이 단위발생란의 체외발달율에 미치는 영향을 조사하여 재래산 양의 최적의 배양조건을 확립하고자 실시하였다. 난자의 회수는 체중 15～25 Kg 전 ㆍ 후의 성숙한 미경산 재래산양에 FSH와 PMSG 를 사용하여 과배란을 유기하여 hCG 투여 후 제 35시간째에 외과적인 방법으로 in vivo (체내성숙) 난자는 난관을 관류하는 방법으로 회수하였고, in vitro (체외성숙) 난자는 난포로부터 흡입하여 난포란을 채취하여 약 22시간 체외성숙을 실시하였다. 활성화 처리는 전기자극법과 Ionomycin + 6-DMAP를 처리하여 단위발생을 유도하였다. 복제수정란의 배양은 M16, TCM-199 및 mSOF 배양액으로 6～7일 동안 체외배양을 실시하였다. 활성화를 유도하기 위하여 전기자극 및 ionomycin + 6-DMAP 처리를 하였을 때 분할율은 각각 64.1 및 76.5%로서 이들간에 차이는 없었다. 배반포기로의 발달율은 전기자극방법으로는 전혀 발달이 이루어지지 않았으나, ionomycin +6-DMAP 처리방법에서는 15.6%가 배반포로 발달하였다. In vivo 난자와 in vitro 난자를 활성화를 유도하였을 때 분할율은 86.8 및 69.0%로서 이들간에 유의적인 차이는 없었다. 4-세포기(93.9% vs 66.1%), 8-세포기(90.9% vs 37.0%) 및 상실배기(89.4% vs 23.6%)는 이들간에 유의적(P<0.05)인 차이가 있었으며, 배반포기로의 발달율은 체내성숙난자가 50.0%로서 체외성숙난자의 0.8%보다는 유의적으로 높았다. 활성화를 유도한 난자를 mSOF 배양액으로 체외배양을 실시하였을 때 분할율은 81.0%로서 TCM-199 +oviduct cell 의 64.3% 및 Ml6 배양액의 51.6%보다는 높게 나타났다. 배반포기로의 발달율은 mSOF 배양액에서는 3.4%가 발달하였으나, TCM-199+ oviduct cell 배양액과 M16 배양액에서는 전혀 발달이 이루어지지 않았다. 이상의 결과는 포유동물 난자의 단위발생의 유도 및 체외배양시 난자의 공급원, 난자의 활성화 방법 및 배양조건 등이 차후 단위발생란의 체외발생율에 크게 영향을 미칠 수 있는 근거를 제시해 준다.

본 연구는 재래산양에 있어서 과 배란 처리에 의한 oocyte의 회수방법과 양질의 oocyte 회수 체계를 확립하기 위하여 과 배란 처리 후 회수시간이 난포의 발달과 난자의 회수율에 미치는 영향을 조사하였다. 공시동물은 체중 15~25 kg 전후의 성숙한 미경산 재래산양으로서 발정동기화를 위하여 CIDR를 10일간 질내에 삽입하고 과배란 처리는 FSH를 CIDR 삽입 8, 9, 10일째에 12시간 간격으로 70 mg을 감량 투여하였다. 는 FSH와 함께

본 연구는 재래산양에 있어서 과배란 처리시 공란 산양의 반복사용에 따른 oocyte의 회수방법과 회수란의 질적 개선방법을 확립하기 위하여 실시하였으며, 성선자극호르몬의 1회 처리와 반복처리, 호르몬제의 종류에 따른 oocyte의 회수율과 등급을 조사하였다. 공시동물은 체중 15~25kg 전후의 성숙한 미경산 재래산양으로서 발정 동기화를 위하여 CIDR를 10일간 질내에 삽입하고 과배란 처리는 70 mg의 FSH 와 1,000 IU의 PMSG를 투여하여

Nicotine(2~15mg/kg 2주간, 100mg/kg 회 투여)을 생후 4개월령 수컷 생쥐에 투여한 후, 고환에 미치는 광학현미경적 소견은 다음과 같다. 1. Nicotine 2mg/kg 투여군에서는 정세관과 정세관 주위의 Leydig 세포도 핵과 세포질이 뚜렷한 정상적인 소견을 나타내었으나, 5 mg/kg 투여군에서는 Leydig 세포의 핵과 세포질이 다소 비후되었으며, 염색정도가 약하였다. 2. 10 mg/kg 투여군은 대부분 정세관내의 정자발