Amnionless-cubulin complex(cubam)과 megalin은 신장 및 소장 등에서 주로 발현되며, 세포 외부에서 내부로 물질을 이동시키는 ligand-mediated endocytosis에 관여하는 단백질이다. Ligand로 작용하는 물질은 vitamine B12, D, albunin, steroid hormone 등 다양한 물질과 결합가능한 multi-ligand receptor로 알려져 있다. Female pituitary는 estrous cycle에 따라 세포의 사멸 및 생성, 호르몬의 생성이 조절된다. 따라서 본 연구에서는 estrous cycle에 따라 세포 내로의 물질 수송의 변화 가능성을 amnionless, cubulin, megalin의 발현 패턴 변화 및 성호르몬에 의한 발현 조절을 통해 밝히고자 하였다. Estrous cycle을 virgina smear를 통해 시기 별로 구분하여 pituitary 내 amnionless, cubulin, megalin의 mRNA 발현 패턴을 real-time PCR로 분석하였으며, pituitary 내 단백질의 분포는 immunohistochemistry로 분석하였다. 또한 estrogen에 의한 protein 발현의 변화를 분석하기 위해 OVX를 시행하여 estrogen을 10일 간 투여하였으며, 비투여군에는 동일 시기 동안 seasame oil을 투여하였으며, ER α KO mouse model을 이용하여 동일 계통의 female mouse diestrus, estrus 시기의 target gene의 발현 패턴을 위와 같은 방식으로 분석하였다. Amnionless mRNA 발현은 estrus 시기 유의적으로 증가하였으며, OVX 시행 시 Sham 대비 유의적으로 감소하였으나, estrogen 투여 시 유의적으로 증가하였다. 또한 ER α KO mouse는 diestrus 시기 대비 유의적인 차이는 없었으나, estrus에 비해 유의적으로 감소하였다. 반면, cubulin 및 megalin은 estrus 시기에 유의적으로 감소하였으며, OVX 시행 시 Sham 대비 유의적으로 증가하였으나, estrogen 투여 시 유의적으로 감소하였다. Pituitary에서 amnioless의 단백질 발현 패턴은 estrus cycle에서는 estrus 시기 단백질 발현량이 증가하였으나, cubulin과 megalin은 단백질 발현의 변화를 구분할 수 없었다. 반면, OVX model의 경우 단백질 발현의 차이는 구분할 수 없었다. 뇌하수체 조직내 Amnionless 및 cubulin의 발현 분포는 OVX control군의 경우 세포질 내에서만 발현하였으나, esrogen 투여군은 이들 단백질이 세포막으로 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. ER α KO mouse의 경우 amnionless의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. Female mouse의 pituitary에서 Amnionless-cubulin complex(cubam)과 megalin의 발현 및 단백질의 분포는 estrogen에 의해 조절된다. 이들 복합체 변동에 따른 pituitary 세포에 필요한 물질수송의 변화는 estrous cycle에 따른 pituitary 기능에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.

혈액 정소 장벽은 정소내에 있는 세정관과 Sertoli cell 사이에 존재하는 물리적 장벽이고, 혈액 부정소 장벽은 부정소 내의 상피세포간의 밀착결합에 의한 장벽이다. 이러한 혈액 정소 장벽과 혈액 부정소 장벽은 내강과 외부 사이의 물질수송에 관여하는 역할을 한다. 정소와 부정소에서는 정자의 형성과 성숙이 일어나기 때문에 이러한 장벽을 통한 물질수송의 조절은 정자의 형성과 성숙에 영향을 미친다. 본 연구에서는 Lipopolysaccharide(LPS)를 투여하여 전신성 염증반응을 일으킴으로서 염증반응에 의한 혈액정소장벽과 혈액부정소장벽의 분자적인 변화와 확산장벽기능의 변화를 조사하였다. 생후 8주령 생쥐에 LPS와 식염수를 각각 투여 후 24시간 뒤 정소 및 부정소를 적출하여 무게측정 뒤 정량적 realtime RT-PCR 방법을 통해 혈액정소장벽과 혈액부정소 장벽 현성에 관여하는 밀착결합 유전자(CAR, Claudins, JAMs, Occludin, Tricellulin, ZO-1) mRNA와 단백질 발현을 분석하였다. 실험군과 대조군에서 적출한 정소와 부정소의 무게를 측정하여 평균을 낸 결과, 무게가 유의적으로 증가하였다. 염증반응의 여부를 확인하기 위하여 TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-18의 mRNA를 realtime RT-PCR로 분석한 결과, TNF-α와 IL-5의 발현이 유의적으로 증가하였다. 정소에서 밀착결합 유전자의 realtime RT-PCR 결과, Cldn 1, 2, 4 mRNA의 발현은 대조군보다 LPS를 복강주사한 실험군에서 유의적으로 증가하였다. JAM3 mRNA 발현은 유의적으로 증가하였고, Occludin과 ZO-1 mRNA 발현은 큰 차이를 보이지 않았다. CAR의 경우, isoform 중 Exon 7번이 마지막인 long form의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였고, Tricellulin의 경우, isoform 중 long form과 mid form의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였다. 부정소에서는 Claudin 유전자와 JAM 유전자중 대부분이 증가하는 양상을 띄었고, 그 중 Cldn5와 JAM2에서 유의적인 증가를 보였다. 부위별로 나눠 유전자 발현을 분석한 결과, 차이를 나타내는 유전자도 있었다. Cldn5 mRNA의 발현은 전체적으로는 유의적으로 증가했으나 부정소 미부에서는 유의적으로 감소하였다. LPS투여군이 대조군보다 밀착결합 유전자 대부분에서 증가하는 양상을 나타내었고 일부는 유의적으로 증가하였다. 면역조직화학법으로 염색한 결과, Cldn1, 4, JAM3, Tricellulin의 경우 발색정도가 증가하였고, CAR의 경우 감소하였다. Biotin tracer를 통해 BTB의 투과성을 확인해본 결과, 대조군에서는 BTB에 막혀서 Sertoli cell 사이로 통과하지 못하였으나, LPS를 투여한 군에서는 BTB를 통과하여 감수분열 중인 정모세포 부근까지 확산되었다. 따라서 정소와 부정소에서 염증반응이 일어나게 되면 혈액정소장벽과 혈액부정 소장벽을 형성하는 밀착결합의 분자적 구조 변화를 초래하고, 이는 확산장벽의 변화시킴으로서 정자 형성과 성숙에 영향을 주어 남성 생식기능에 영향을 미칠 것으로 예측된다.

무당개구리(B. orientalis)의 수정란은 수정 후 약 24h에 원구입술을 형성하며, 이 원구의 고리를 통해 이동하는 세포가 중배엽을 형성하고, 중배엽의 수렴확장에는 noggin, chordin, follistatin이 큰 영향을 미친다. Mercuric chloride는 높은 독성, 생물 농축적 특성을 갖는 가장 위험한 중금속 중 하나이다. 본 연구는 양서류 초기배아의 중배엽 형성과정에서 수은 이온에 의해 유발되는 중배엽 발생저해 효과를 DMZ explants를 이용하여 체외분석 및 유전자 발현 분석하였다. 무당개구리 배아는 hCG를 주사하여 획득하였으며, 획득한 배아는 22℃에서 발생시켰다. 동물극 유도 시에는 후기 포배의 배아 동물극 정중앙을 1～2 mm 크기로 절개하여 이용하였고, DMZ 분리는 원구입술의 크기가 배아 둘레 기준으로 약 1/8 정도 확장된 배아가 되었을 때 절개하여 실험에 사용하였다. 24-well tissue culture plate에 1X MR로 조제한 1.5% agarose 고체배지 500μl에 1X MR, penicillin(1μl/ml), streptomycin(10μl/ml), BSA(0.25μl/ml)로 조제한 액체 배양액 500μl를 첨가하여 배양하였다. 동물극의 중배엽 유도를 위한 실험군에는 추가적으로 Activin-A를 2.0 ng/ml의 농도로 처리하였다. Mercuric Chloride는 3차 증류수에 녹인 후 0(vehicle control group), 0.1, 1, 10 μM의 농도로 배양액에 처리하여 20℃에서 배양하며, 12시간 경과 후 DMZ explant의 수렴확장 정도를 이미지 분석프로그램을 통해 수치화 하였다. 배양된 explants는 RT-PCR을 이용하여 cDNA로 합성하고, noggin, chordin, follistatin의 발현량을 측정하였다. 실험결과, 동물극의 중배엽 유도 실험에서는 확장 정도를 의미하는 길이신장은 10μM(2.715 mg/L) 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 수렴 정도를 의미하는 동물극 신장 부위의 두께는 10μM(2.715 mg/L) 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 반면, 종합적인 수렴확장 정도의 비교를 위한 길이/폭 비율에서는 유의적인 차이가 발견되지 않았다. DMZ explant의 확장 정도를 의미하는 길이신장은 10μM(2.715 mg/L) 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 반면, 수렴 정도를 의미하는 DMZ explant 두께는 수은이온처리에 따른 차이가 발견되지 않았다. 종합적인 수렴확장 정도의 비교를 위한 길이/폭 비율은 10μM(2.715 mg/L)의 수은이온 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 유전자 발현량 측정 결과, 동물극의 중배엽 유도 실험에서는 noggin의 경우 1, 10μM에서, chordin의 경우 0.1, 1, 10μM에서, follistatin의 경우 1, 10μM에서 감소하는 양상을 보였다. DMZ explant 배양에서는 통계적으로 유의한 수렴확장저해가 확인되지 않았다. 무당개구리 배아를 이용한 Mercuric Chloride의 중배엽 형성저해 분석 결과, 10μM(2.715 mg/L) 이상의 농도는 DMZ의 길이 성장, 길이/폭 비율을 저해시키며, 동물극의 중배엽 형성 유도에서는 길이 성장, 폭 성장을 저해시키는 것으로 확인되었다. 동물극의 중배엽 유도군에서 수렴 확장 정도에서의 변화가 나타나지 않은 것은 길이와 폭의 성장이 모두 저해되었기 때문에 비율의 변화값이 고정되었음에 따른 것으로 사료된다. 또한 유전자 발현양상을 분석한 결과 길이 측정결과에서 보였던 결과와 마찬가지로 농도 의존적으로 감소하는 양상을 보였으므로 수은이 중배엽 형성을 저해하는 효과를 가졌음을 확인할 수 있었다. 단, DMZ explant 군에서의 변화양상이 없는 것으로 보아, 차후 중배엽 형성 저해 실험을 관찰할 때에는 동물극 유도 실험군을 이용하는 것이 더 바람직할 것으로 사료된다.

정소 내 생식세포 분화가 이루어지는 세정관과 혈관 사이에 존재하는 blood-testis barrier (BTB)는 다양한 밀착결합(tight junction) 단백질로 이루어져 있다. Claudin-11은 이러한 밀착결합을 구성하는 단백질 중 하나로 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 토끼(domestic rabbit; Oryctolagus cuniculus domesticus), 꿩(pheasant; Phasianus colchicus), 자라(soft shelled turtle; Pelodiscus sinensis)의 정소에서 claudin-11의 발현을 관찰하고, 성적 성숙 또는 번식기에 따른 변화를 확인하고자 하였다. 이를 위해 각 동물의 claudin-11 partial cDNA 염기서열을 확보하고 이를 통해 RT-PCR을 수행하였다. 또한 정소 조직 내에서 claudin-11 발현 부위를 확인하기 위해 면역염색을 시행하였으며, western bolt을 통해 단백질발현을 확인하였다. 토끼와 꿩의 정소에서 claudin-11은 성적으로 성숙한 이후에, 자라의 경우 생식세포의 분화가 활발히 일어나는 비번식기에 mRNA 발현량의 급격히 증가하였으며, 이는 단백질의 발현량과 일치하는 것을 확인하였다. 성적 성숙이 일어나지 않은 토끼와 꿩 및 번식기 자라의 정소내에서 claudin-11 발현은 주로 Sertoli cells 및 그 사이에서 확인되었다. 그러나 생식세포 분화가 활발한 시기의 세정관 내에서 claudin-11은 Sertoli cells 및 그 사이 뿐만 아니라 Sertoli cell이 spermatogonia와 접하는 바닥면에 물결형태로 분포하는 것이 확인되었다. 이는 포유류뿐만 아니라 조류에서도 claudin-11이 생식세포 분화를 진행하는 세정관 내에서 BTB를 구성하고 있음을 의미한다. 또한, 계절에 따라 생식세포 군집의 변화를 보이는 자라의 정소에서 생식세포 분화가 활발한 시기에 claudin-11이 BTB 구성에 참여하는 것이 확인되었다. 꿩의 정소 및 정소(organ culture)에서 분리해 낸 Sertoli cells(primary culture)를 이용한 실험에서 testosterone 처리에 따라 claudin-11 mRNA가 증가하는 것이 확인되었으며, 자라의 호르몬을 분석한 결과, 세정관내 생식세포 분화가 활발한 시기에 testosterone 농도가 높아지는 것을 확인하였다. 이는 claudin-11이 남성호르몬의 조절을 받으며, 생식세포의 분화가 활발한 시기의 높은 농도의 남성호르몬은 세정관내부 환경을 독립적으로 유지할 수 있도록 claudin-11이 포함된 BTB를 발달시키는 것으로 사료된다. 본 연구를 통해 현재까지 잘 알려져 있지 않은 조류와 파충류 정소에서의 claudin-11 발현을 확인하였으며, 정소 내 고유환경 조성에 참여하는 것은 claudin-11이 진화선상에서 갖는 공통된 기능임을 확인하였다.

DEHP(di-ethylhexyl phthalate)는 가장 널리 쓰이는 플라스틱 가소제로서 인체노출 빈도가 매우 높은 내분비계장애물질이다. 본 연구는 임신기와 수유기 동안의 DEHP 노출이 후세대 생쥐 암컷 난소 및 난자에 미치는 영향을 알아보기 위한 목적으로 난소의 기능유전체 발현 변동을 조사하고, 유전자 발현 결과를 토대로 새로운 생식독성 마커를 발굴하고자 하였다. DEPH를 임신(GD) 1일째부터 수유기에 해당하는 출생 후(PND) 20일까지 모체에 0, 1.5 mg/kg/day 농도로 경구투를 한 후, F1 암컷의 난소 RNA를 추출하여 microarray 분석을 수행하였다. Expression Console software version1.1을 이용하여 발현변화가 나타난 유전자 정보를 획득하였다. 대조군과 1.5 mg/kg/day 처리군의 난소조직의 microarray 분석 결과, 약 120여 개의 유의적인 차이를 나타내는 유전자 정보를 확보하였으며, 특히 골지체에 존재하는 당전이효소인 fucosyltransferase 11(FUT11)이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 난소 내 FUT11의 발현 양상을 확인하기 위하여 발정주기에 따른 난소 FUT11 발현, 과배란을 유도한 후 난포 성숙과정에서의 FUT11 mRNA 및 단백질 발현 변화를 분석하였다. 발정주기에 따른 난소 조직에서의 FUT11발현은 발정기시기에 가장 높았으며, granulosa luteal cell, oocyte, interstitium에서 FUT11 단백질 발현이 확인되었다. 과배란을 유도한 난소조직에서는 PMSG 46 h 째에서 FUT11의 발현이 가장 높았다. DEHP는 임신기 및 수유기를 통해 장기간 노출될 경우 후세대 암컷의 난소기능 및 난자에 기능적 문제를 야기한다. FUT11은 인체질병 발생시 비정상적인 당잔기의 합성에 관련이 있을 것으로 보고된 바 있다. 실제로 암 조직이나 염증부위의 단백질 및 당지질의 당쇄부위에 fucosylation이 증가한다. 본 연구 결과에서 DEHP의 장기 노출이 후세대 암컷 생쥐 난소내 FUT11 발현을 증가시켜 난소 내 granulosa luteal cell, interstitium, oocyte에서 생성되는 단백질의 당쇄구조의 비정상적인 fucosylation을 유발함으로서 난소의 내분비기능과 및 난자성장 및 성숙에 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다.

남성의 체내에 미량의 estrogen이 존재하며, 정소와 부정소에 estrogen receptor(ERα, β)가 발현한다. Estrogen은 estrogen receptor를 통한 signaling을 통해 기능을 수행한다. 본 연구에서는 출생직후, 생후 1, 2, 4, 8주령의 생쥐 정소 및 부정소를 획득한 후 정량적 RT-PCR, Western blot, 면역조직화학법, image analysis를 통해 ERα의 발현을 분석하였다. 생쥐의 주령별 정소에서 ERα mRNA의 발현분석 결과, 정소에서는 신생부터 1주령까지 발현량이 급격히 증가하였으며, 4주령부터 약간 감소하였다. Western blot 결과, 출생 직후부터 생후 7일까지 급격히 증가하였고, 14일까지 높은 수준으로 발현하다가 이후 감소하였다. 면역조직화학법을 통한 ERα의 발현부위분석 결과, 정소에서 ERα 단백질은 주로 leydig cell과 peritubular cell에서 발현하였다. Image analysis를 통한 ERα 발현의 양적분석 결과, leydig cell에서 ERα는 출생 직후에 낮게 발현하다가 7일까지 급격히 증가하였고, 14일까지 높은 발현량을 유지하다가 이후 감소하였다. 이는 발생단계에 따른 남성호르몬 농도와 상반되는 결과로서, ERα의 발현이 leydig cell의 증식과 남성호르몬의 생성을 억제하는 것으로 추측할 수 있다. Peritubular cell에서 ERα는 출생 직후부터 생후 14일까지 꾸준히 증가하다가 이후에 급격히 감소하였다. ERα는 peritubular cell의 증식에도 관여하는 것으로 사료되며, 발생단계에서 leydig cell에 비해 peritubular cell의 증식이 먼저 완료되는 것으로 사료된다. 이를 종합하면, ERα는 정소에서 스테로이드형성 및 leydig cell/peritubular cell의 증식에 관여할 것으로 사료된다.

Aquaporins (AQPs)는 수분통로단백질로서 세포막에서 수분 또는 글리세롤의 수동수송에 관여한다. 현재까지 13종의 AQPs (AQP0-12)가 알려져 있으며, 이 중 AQP9은 수분통로뿐만 아니라 선택적 중성용질통로로도 작동한다. 정소에서 AQP9은 Leydig cell에서 발현하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 정소에서 AQP9의 역할을 알아보기 위해 생쥐 정소에서 생후 발달에 따른 AQP9의 발현과 human chorionic gonadotropin (hCG)에 의한 조절에 대하여 조사하였다. 생쥐 정소에서 AQP9 mRNA와 단백질은 2주령부터 발현하였고, 4주령부터 발현량이 급격히 증가하였다. Laser captured microdissection (LCM)을 이용하여 interstitial cell에서 AQP9 mRNA 발현을 분석한 결과, 1주령까지 낮은 발현을 보였고, 이후 발현량이 점진적으로 증가하였다. Immunohistochemistry로 AQP9을 염색한 후 quantitative image analysis를 시행한 결과, 2주령까지 Leydig cell에서 약한 immunoreactivity를 보이다가 4주령부터 세포 크기의 증가와 함께 강한 immunoreactivity를 보였다. Double immunofluorescence로 AQP9과 3β-HSD를 염색한 결과, 미성숙 정소에 비해 성체 정소의 Leydig cell에서 immunoreactivity가 유의적으로 증가하였다. 3주령 수컷 생쥐에 hCG를 주사한 후 정소에서 AQP9 mRNA 발현을 분석한 결과, 발현량이 증가하였으며, adult Leydig cells primary culture를 진행하면서 hCG를 처리한 결과, steroidogenic enzyme 유전자들의 mRNA 발현이 증가하면서 AQP9 mRNA 발현도 증가하였다. 따라서 Leydig cell에서 AQP9은 luteinizing hormone (LH)에 의해 조절되어 수분 및 중성용질을 수송함으로써 steroidogenesis 과정에서 세포 부피의 조절에 관여하는 것으로 사료된다. 흰쥐를 이용한 선행연구들과는 달리 본 연구에서는 세정관내에서도 AQP9이 발현하는 것을 확인하였다. 정소 내 세정관을 분리하여 AQP9 mRNA 발현을 분석한 결과, 2주령부터 mRNA가 발현하는 것이 확인되었고, 이후 발현량이 점진적으로 증가하였다. 또한 LCM을 이용하여 성체 정소의 세정관에서 AQP9 mRNA가 발현하는 것을 확인하였다. Double immunofluorescence로 AQP9과 claudin-11을 염색한 결과, Sertoli cell들간의 밀착결합 (tight junction)에서 함께 발현하는 것을 확인하였다. 따라서 Sertoli cells 사이의 AQP9은 수분 및 중성용질의 통로로 작동하여 이들이 혈액정소장벽 (blood testis barier)을 통과할 수 있게 하는 것으로 사료된다.

스피루리나 (Spirulina, Arthrospira platensis)는 미세조류에 속하는 섬사 형태의 시아노박테리아로서 오랜 기간에 걸쳐 식용으로 재배되어 공급되고 있으며, 최근 30여년 동안 스피루리나를 이용한 당뇨병과 같은 인간의 질병 개선효과에 대한 연구가 수행되고 있다. 스피루리나의 당뇨 개선 효과는 이미 알려져 있으나, 생식내분비계에서의 영향에 대한 연구는 거의 전무한 상황이다. 본 연구에서는 스피루리나의 섭취에 따른 당뇨 유발 동물 모델에서의 생식 내분비계 영향에 대하여 알아보고자 하였다. 6주령 SD rat 60마리를 대상으로 Streptozotosin (STZ) 50mg/kg을 1회 주사한 당뇨 유발 실험군과 4주간 스피루리나 200mg을 섭취한 실험군, STZ 주사 직 후 4주간 스피루리나를 섭취한 실험군, 2주간 스피루리나 섭취 후 STZ를 처리한 실험군, STZ 주사 후 2주 경과한 실험군을 확보하였다. 각각의 개체로부터 체중, 정소조직의 중량 변화 및 혈중 testosterone 농도를 분석하였으며, 정소 조직에서의 steroidogenesis 조절 유전자인 SF-1, StAR, 17β-HSD, 3β-HSD와 antioxidative pathway marker 유전자인 peroxiredoxin (Prdx) 4의 발현 변화를 realtime-PCR로 분석하였다. 정소조직 내의 Leydig cell의 변화 여부를 확인하기 위하여 Leydig cell의 세포수를 확인하였다. STZ 처리 후 스피루리나를 섭취한 실험군의 체중, 생식기관의 중량, 혈중 testosterone 농도 및 steroidogenesis 조절 유전자들의 발현이 STZ 단독 처리군보다 유의적으로 증가하였으며, 스피루리나를 2주간 먹인 후 STZ를 처리한 실험군에서 STZ를 단독 처리한 실험군보다 정소 무게가 유의적으로 증가하였다. Prdx 4의 발현이 스피루리나를 섭취한 STZ 처리군에서 STZ 단독 처리군에 비해 유의적으로 감소하였으며, Leydig cell 수가 스피루리나를 섭취한 실험군에서 증가하였다. 본 연구결과에서 스피루리나의 섭취가 제1형 당뇨로 인한 체중, 혈중스테로이드호르몬 농도 및 Leydig cell 감소를 완화하여 당뇨에 따른 남성생식기능의 저하를 예방하는 것으로 사료된다.

Prostaglandin D2 (PGD2)는 배아의 성결정 단계에서 Sertoli cell 분화의 주요인자인 SOX9의 발현을 촉진한다. PGD2는 Prostaglandin D synthase (PGDS)에 의해 Prostaglandin H2 (PGH2)가 이성화되어 만들어진다. PGDS는 스테로이드 생성 관련 유전자인 3β-HSDⅥ, 17β-HSDⅢ와 함께 Leydig cell에서 사춘기 이후 발현되는 것으로 알려져 있으며, lipocalin-type PGDS (L-PGDS)와 hematopoietic PGDS (hPGDS)가 있는 것으로 알려져 있다. L-PGDS는 수컷특이적인 효소로 알려져 있으나, hPGDS는 수컷의 생식소에서는 그 기능이 알려져 있지 않다. 또한, L-PGDS는 여러 조직에서 estrogen에 의해 조절된다고 알려져 있으나, 정소에서는 정확한 조절양상이 알려져 있지 않다. 본 연구는 정소내에서 정자형성 및 스테로이드 생성과정에서 두 가지 형태의 PGDS에서 생성된 각각의 PGD2의 역할을 규명하기 위한 일환으로 생쥐 정소 발생과 성숙단계에 따른 PGDS와 PGD receptor 및 GPR44의 발현을 조사하였으며, estrogen에 의한 PGD2 system의 조절양상을 규명하기 위해 ERα KO와 WT 생쥐에서의 L-PGDS, hPGDS, PGD receptor, GPR44의 발현을 조사하였다. 생후 1, 7, 14, 28, 56일령 생쥐 정소 및 ERα KO와 WT 생쥐 정소로부터 total RNA를 추출하여 정량적 RT-PCR법으로 L-PGDS, hPGDS, PGDR, GPR44의 mRNA 발현을 분석하였고, 정소 파라핀 절편에서 면역조직화학방법으로 L-PGDS, hPGDS, PGDR, GPR44의 단백질 발현을 분석하였다. ERα KO와 WT생쥐 정소 파라핀 절편에서 면역조직화학법을 통해 L-PGDS의 단백질 발현 정도를 분석하였다. 생쥐 정소에서 hPGDS, L-PGDS, GPR44, PGDR의 mRNA 모두 사춘기(생후 28일)이후 발현이 유의적으로 증가하였다. GPR44와 PGDR의 mRNA는 사춘기 이전에는 거의 발현되지 않았다. 하지만 L-PGDS의 경우는 생후 7일, 14일에 비해 생후 1일에서 높은 mRNA 발현량을 보였다. ERα KO와 WT 생쥐 정소 mRNA의 경우 hPGDS와 PGR에서는 차이를 보이지 않았으나 L-PGDS와 GPR44에서는 WT 생쥐보다 ERα KO 생쥐에서 낮은 발현량을 보였다. 면역조직화학법 결과, L-PGDS와 hPGDS는 생후 1일의 fetal Leydig cell에서 주로 발현하였으며, 사춘기 이후 adult Leydig cell에서 발현하였다. GPR44는 Sertoli cell에서 발현되며, 신생기에는 Spermatogonia에, 사춘기에는 elongating spermatid와 round spermatid에, 성체기에는 Leydig cell에서도 발현된다. PGDR은 생후 1일에서 Sertoli cell에서 발현되고, 사춘기와 성체기의 Sertoli cell과 Leydig cell에서 발현된다. 그리고 ERα KO 생쥐에서 L-PGDS는 WT 생쥐보다 낮은 단백질 발현량을 보였다. L-PGDS와 hPGDS는 fetal 및 adult Leydig cell에서 발현되므로 PGD2는 Leydig cell에서 발현되는 PGDR을 통해 Leydig cell의 분화 및 스테로이드 형성과정에 관여하는 것으로 사료된다. 또한 PGD2는 Sertoli cell과 germ cell에서 발현되는 GPR44를 통해 정자형성과정에 관여하는 것으로 사료된다. 그리고 estrogen에 의해 L-PGDS와 GPR44의 mRNA가 발현량이 증가하는 방향으로 조절되고, 그로 인한 단백질 발현 또한 증가하는 방향으로 조절되는 것으로 사료된다.

성장호르몬 치료는 성장호르몬 결핍증, 터너증후군, 만성 신부전증, 프라더 월리 증후군 등으로 인해 성장장애가 온 아동인 경우 수행되지만 성장호르몬의 과다 투여로 인한 부작용에 대해서는 여전히 논란의 여지가 많은 상황이다. 본 연구에서는 유아기 성장호르몬의 노출이 사춘기 시기의 성성숙 및 생식 내분비계에 미치는 영향에 대하여 알아보고자 하였다. PND21부터 PND28까지 1주일간 각각 10마리의 수컷 SD rat에 Growth hormone (rhGH) 1, 2 IU/kg/day를 피하주사하였다. 대조군 (10마리)으로는 식염수 0.1ml을 투여하였으며, 체중 변화를 매일 0.1g 단위로 측정하며 기록하였다. 사춘기 도래시기의 변화를 분석하기 위하여 음경꺼풀분리 (preputial separation) 일자를 기록하였으며, 사춘기 (PND28) 시기의 주요 생식기관의 중량변화 및 조직학적 변화를 분석하였다. 시상하부에서 사춘기 조절에 관여하는 kiss1 및 GnRH의 발현 변화를 확인하였고, 혈중 testosterone 농도 및 정소에서 스테로이드호르몬 분비에 관여하는 유전자들의 발현 변화를 확인하였다. 정소조직 내 Leydig cell의 면적 및 세포수를 이미지 분석 시스템을 이용해 분석하였다. 모든 GH 처리군에서 유의적인 체중 증가가 나타났으며, 2IU 처리군에서 음경꺼풀이 대조군에 비해 조기에 분리되었다. GH 2IU/kg 처리군에서 정소와 부정소, 정낭샘 및 음경꺼풀샘의 중량이 유의적으로 증가하였고, 시상하부에서 kiss1 및 GnRH의 발현이 유의적으로 감소하였다. 혈중 testosterone의 농도가 2IU 처리군에서 유의적으로 증가하였으며, 정소에서 스테로이드 호르몬 합성 유전자인 17β-HSD, SF-1발현이 증가하였다. GH 처리군에서 Leydig cell의 면적과 세포수가 유의적으로 증가하였다. 성장호르몬에 노출될 경우 개체의 성장 및 기관 발달이 촉진되지만, 과다 노출될 경우 steroid의 합성과 분비조절 기능의 변형이 예상되며, 사춘기 조기 도래를 유발할 가능성이 있는 것으로 사료된다.

남성의 체내에 미량의 estrogen이 존재하며, 정소와 부정소에 estrogen receptor (ERα, β)가 발현한다. Estrogen은 ERα와 ERβ를 통해 세포의 생존, 증식 및 분화를 조절한다. ERα는 정소에서 스테로이드형성, 정자형성 부정소에서 정자 성숙 및 부정소 체액항상성 조절기능을 수행할 것으로 추측된다. 본 연구에서는 출생 직후, 생후 1, 2, 4, 8주령의 생쥐 정소 및 부정소를 획득한 후 정량적 RT-PCR, Western blot, 면역조직화학법을 이용하여 ERα의 발현을 확인하였다. 생쥐의 주령별 정소와 부정소에서 ERα mRNA의 발현분석 결과, 정소에서는 신생부터 1주령까지 발현량이 급격히 증가하였으며 4주령부터 약간 감소하였다. 부정소에서는 신생부터 4주령까지 비슷한 발현량을 보였으며, 8주령에서 발현량이 증가하였다. Western blot 결과, 8주령 부정소에서 efferent duct에서 가장 강하게 발현하였고, 부정소 체부에서 가장 적게 발현되었다. 면역조직화학법을 통한 ERα의 발현부위분석 결과, 정소에서 ERα 단백질은 주로 Leydig cell과 peritubular cell에서 발현하였다. 부정소에서는 efferent duct와 두부 부정소에서 가장 강하게 발현되었으며, 두부 부정소의 principal cell과 narrow cell에서 강하게 발현되었다. 체부 부정소에서는 basal cell과 clear cell에서 발현하였다. 미부부정소에서는 stromal cell에서 강하게 발현하였고, basal cell과 clear cell에서도 발현되었다. ERα는 정소에서 스테로이드형성 및 Leydig cell의 증식에 관여하며, 부정소에서 정자의 성숙 및 저장에 관여할 것으로 사료된다.

부정소 상피세포에서 형성되는 밀착결합 (Tight Junction, TJ)은 혈액-부정소장벽 (blood-epididymal barrier, BEB)을 형성하여 이온과 저분자물질의 이동을 제한하여 수분항상성에 기여하며, 정자의 성숙환경을 제공한다. TJ는 세포질 내부로 세포질골격 및 다양한 신호전달 분자와 복합체를 형성하고 있으므로 다양한 세포 내외부의 신호에 반응하여 그 구조와 기능이 역동적으로 조절된다. 정소와 부정소에 estrogen receptor (ERα, β)가 발현하며, 부정소에 비교적 높은 농도로 존재하는 estrogen은 부정소 체액항상성 조절에 관여하는 것으로 알려졌다. 본 연구에서는 estrogen에 의한 부정소 관강내 정자성숙 환경조성 기작 규명의 일환으로 ERαKO (ERα－/－) 생쥐의 부정소에서 TJ 발현을 비교분석하였다. 5개월령 ERαKO 생쥐의 부정소를 획득하여 무게측정 및 조직학적 분석을 시행하였다. 또한, 부정소를 각 부위별 (두부, 체부, 미부)로 나누어 RT-PCR 및 면역조직화학법으로 밀착결합 유전자인 claudins (-1, -2, -3, -4, -5, -11), occludin, JAMs (-1, -2, -3), CAR, tricellulin 발현을 분석하였다. WT에 비해 ERαKO 생쥐 부정소의 무게는 유의적으로 감소하였고, 정자형성 장애로 인해 부정소 내부에는 정자가 관찰되지 않았다. 또한 efferent duct 내강이 팽태되었다. ERαKO 생쥐 두부 부정소의 경우 cla-1, JAM-1, occludin, tricellulin mRNA 발현이 유의적으로 감소하였고, cla-11 mRNA는 감소하는 경향을 나타냈으나 유의성은 없었다. 체부 부정소는 TJ 유전자 발현에 큰 변화를 나타내지 않았으며, 미부 부정소에서는 cla-5, JAM-1, -3 mRNA 발현이 증가하는 경향을 나타냈으나 유의성은 없었다. 면역조직화학적 분석결과, cla-1은 principal cell의 세포질에서 강하게 발현하였으며, cla-11은 interstitium에서 주로 발현하였고, WT과 ERαKO 간에 유의적인 차이가 나타나지 않았다. Occludin은 initial segment의 상피세포 apical 부분에서 주로 발현하였고, efferent duct에서 WT에 비해 강하게 발현하였다. JAM-1은 ERαKO의 두부 부정소에서 principal cell의 apical 부위에서 발현이 감소하였다. 부정소 두부와 미부에서 estrogen은 ERα를 경유하여 TJ 유전자 발현을 조절함으로서 정자성숙과 저장환경 조성에 작용하는 것으로 사료된다.

DEHP (di-ethylhexyl phthalate)는 인체노출 정도가 매우 높은 산업물질로 내분비계 장애물질이다. 임신기와 수유기를 통한 DEHP의 노출이 암컷의 사춘기 도래 및 생식내분비계에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. DEPH를 임신 (GD) 18일째부터 수유기에 해당하는 출생 후 (PND) 20일까지 모체에 0, 0.015, 0.15, 1.5, 15, 150 ㎎/㎏/day 농도로 경구투여하였다. 산자 암컷에서 PND 56일까지 발정주기 횟수를 확인하였다. 휴지기 (diestrus)와 발정기 (estrus) 시기의 mouse를 선별하여 난소 내 황체 수와 면적을 조직학적으로 분석하였으며, 과배란을 유도한 후 배란 난자 수 및 성숙도를 분석하였다. 혈중 E2농도를 측정하였으며, 휴지기와 발정기 시기의 난소에서 estrogen의 합성을 조절하는 aromatase (Cyp19a1)와 sex steroid의 합성에 필요한 콜레스테롤의 이동에 관여하는 steroidogenic acute regulatory protein (StAR) mRNA 발현을 realtime PCR로 분석하였다. 또한, DEHP에 의한 난소 내 비 정상적으로 남성화된 세포의 출현 여부를 확인하기 위해 Sertoli cell 분화조절인자로 알려진 SOX9의 발현 변화를 realtime PCR로 확인하고 면역조직화학염색을 통해 난소 내 SOX9을 발현하는 세포의 수와 면적을 분석하였다. DEHP에 노출된 F1 암컷의 발정기 도래간격이 15, 150 ㎎/㎏/day 처리군에서 길어졌으며, DEHP 0.15. 1.5, 15, 150 ㎎/㎏ 처리군에서 발정기의 횟수가 유의적으로 감소하였다. 난소 내 황체의 수가 DEHP 1.5, 15, 150 ㎎/㎏/day 실험군에서 발정기 동안 유의적으로 감소하였으며, 과배란 난자수도 DEHP 1.5, 15, 150 ㎎/㎏/day 실험군에서 감소하였으며, 형태 이상이 증가하였다. 발정기 혈중 E2 농도가 DEHP 1.5, 15, 150 ㎎/㎏/day 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 1.5, 15, 150 ㎎/㎏/day 실험군의 발정기 난소에서 Cyp19a1, StAR 의 발현이 유의적으로 감소하였다. SOX9 mRNA 발현이 DEHP 0.15 ㎎/㎏/day 실험군에서 발현이 증가되었으며, SOX9이 발현되는 theca cell의 면적이 유의적으로 증가하였다. DEHP가 임신기 및 수유기를 통해 장기간 노출된 암컷의 성장에 영향을 미칠 가능성이 높으며, 암컷 생쥐의 사춘기 도래시기의 변형, 발정주기 불규칙화와 같은 주변적 사춘기의 변형을 유발하는 것으로 사료된다. 혈중 E2 농도 감소, 황체 수 감소 및 스테로이드형성 유전자 발현의 감소를 통해 DEHP가 난소에서의 estrogen 합성과 분비조절 기능을 교란시키는 것으로 판단되며, 난소 내 theca cell의 비정상적인 분화를 유발하여 난포의 성숙을 저해할 가능성이 있을 것으로 사료된다.

부정소 상피세포에 존재하는 Tight junctions (TJs)는 물질 확산장벽으로 작동하며, 혈액-부정소 장벽 (blood-epididymal barrier, BEB)을 형성한다. 본 연구는 부정소 TJ 발현에 미치는 정소액의 영향을 확인하고자 수출관 결찰 (effrent duct ligation, EDL) 생쥐 부정소에서 TJ 유전자 발현변동을 조사하였다. 생후 8주령 생쥐를 정소수출관 결찰을 시행, 15일 후 부정소를 획득하여 정량적 RT-PCR법으로 TJs 유전자의 mRNA 발현을 분석, 면역조직화학법으로 단백질 발현 변화를 분석하였다. 수출관 결찰결과 EDL 부정소 중량은 감소하였고, initial segment 상피세포의 두께가 얇아졌다. EDL 부정소 두부에서 claudin-1, -11, JAM-3 mRNA 발현이 증가하였고, claudin-2 mRNA 발현은 감소하였다. 체부에서는 claudin-1, -3, -11, JAM-1, -3, tricellulin mRNA 발현이 증가하였고, tricellulin은 미부에서 mRNA 발현이 증가하였다. 면역조직화학적 분석결과, EDL 부정소 initial segment에서 claudin-2 발현이 감소하였다. CAR는 두부에서 발현이 감소하나 체부와 미부에서 증가하였다. JAM-1은 체부와 미부의 상피세포 내 발현이 증가하였다. 수출관 결찰시 initial segment TJ 조성에 많은 변화가 유발되었다. 부정소상피의 밀착결합은 정소기원의 생물학적 활성인자들의 영향하에 조절되는 것으로 사료된다.

부정소 상피세포에서 형성되는 밀착결합 (Tight junction, TJ)은 혈액-부정소장벽을 형성하여 정자의 수송, 저장 및 성숙에 필요한 부정소 내부환경을 조성한다. TJ는 occludin, claudins, JAMs, CAR, tricellulin 등의 integral membrane protein과 ZO-1 등의 plaque protein으로 구성된다. 한편, 정관결찰(Vasectomy)은 부정소 관강 내 삼투압 및 상피세포에서 분비되는 단백질조성을 변화시키며, 항정자항체의 형성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 정관결찰에 따른 부정소 관강 내 정자의 성숙 및 저장환경 변화를 규명할 목적으로 부정소 상피세포 TJ 유전자 발현을 조사하였다. 생후 1, 2, 4, 8주령 부정소를 사용하였다. 생후 8주령 생쥐에서는 부정소 두부, 체부, 미부 부위별로 절취하여 분석하였다. 8주령 생쥐에 정관결찰 시행 6주 후 부정소를 획득하여 해부조직학적 변화 유무를 확인 한 후 RT-PCR 및 면역조직화학법으로 claudins (-1, -2, -3, -4, -5 -11), occludin, JAMs (-1, -2, -3), CAR, tricellulin 발현 변화를 분석하였다. Cla-2 mRNA는 두부 부정소에서만 강하게 발현하였으며, Cla-1, JAM-2 mRNA는 체부 부정소에서 다른 부위보다 강하게 발현하였다. Cla-4 mRNA는 체부 부정소에서는 거의 발현하지 않았고 두부와 미부 부정소에서 발현하였다. Occludin mRNA는 두부와 체부 부정소에서 미부 부정소보다 많이 발현하였다. CAR mRNA는 두부 부정소에서 약간 강하게 발현하였다. Cla-1, JAM-2는 principal cell에서 주로 발현하였다. Occludin, JAM-1, CAR는 apical membrane에서 발현하였으며, tricellulin은 근육층에서 발현하였다. 정관결찰 후 부정소 중량이 증가하였고 체부와 미부 부정소관이 비후는 상피세포 두께의 감소와 근육층 비후를 동반하였다. 정관결찰 모델의 두부 부정소에서 밀착결합 유전자 중 cla-2, -3, -11, JAM-2, -3, tricellulin mRNA 발현이 증가하였다. 또한 체부 부정소에서는 cla-1, -3, -4, JAM-1, -2 mRNA, 미부 부정소에서는 JAM-3 mRNA의 발현이 증가하였다. 부정소 관강 내부 정자 성숙환경 조성에 관여하는 TJ 유전자 발현은 부정소 부위별로 차등적으로 발현됨을 확인하였다. 정관결찰에 의한 부정소 상피세포의 TJ 유전자 발현의 변화는 부정소 내부의 물리적 압력의 증가와 체액 삼투압의 변화에 따른 대응기작으로 사료된다. 또한 부정소 중량 증가와 부정소 체부와 미부의 해부조직학적 변화는 부정소 부위별 분절화 특성에 관여하는 상위의 유전자 조절네트웍의 변형을 암시하므로 이에 관여하는 유전체들에 대한 연구가 필요하다.

Estrogen은 estrogen receptor alpha와 beta (ERα, ERβ)를 통해 세포의 생존, 증식 및 분화를 조절한다. 남성의 체내에 미량의 에스트로젠이 존재하며, Leydig cell은 ERα와 ERβ를 발현하므로 에스트로젠은 Leydig cell의 증식 또는 스테로이드형성에 조절기능을 수행할 수 있을 것으로 추측된다. ERα가 전신적으로 적중 (ERαKO)된 수컷 생쥐는 정자형성, 스테로이드생성 및 생식력에 심대한 결함이 있다. 하지만 ERα는 뇌하수체에서도 발현되므로 전신성 ERαKO 모델로 Leydig cell 특이적 ERα의 기능을 이해하기에는 한계가 있다. 본 연구에서는 Leydig cell 특이적 ERα 적중 (ERαflox/flox Cyp17iCre) 생쥐의 정소에서 정자형성, Leydig cell의 증식과 분화특성을 규명하고자 하였다. 생후 2～14개월령의 wild type (WT)과 ERαflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐를 이용하였다. WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐의 혈액을 채취하여 혈중 testosterone, FSH 및 LH 농도를 RIA 분석하였다. WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐에서 정소중량을 측정한 후, 파라핀절편을 제작하여 HE 염색을 통해 세정관의 조직학적 특징을 분석하였고, 3β-HSD 면역조직화학법으로 Leydig cell의 수, 단위세포의 면적을 이미지분석 프로그램으로 분석하였다. 또한 WT 암컷과의 교배를 통해 ER αflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐의 생식력을 분석하였다. WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 혈중 testosterone, FSH 및 LH의 농도는 유의적인 차이가 없었다. 정소 중량은 2～4개월령에서는 유의적인 차이가 없었지만 10～14개월령에서 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐의 정소 무게가 WT에 비해 유의적으로 낮았다. 정자형성 장애를 보이는 세정관의 비율은 WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 유의적인 차이가 없었다. 3β-HSD 염색을 통한 Leydig cell의 분석 결과, Leydig cell 수에는 유의적인 차이가 없었지만, 6개월령부터 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 WT에 비해 Leydig cell의 면적이 유의적으로 작았다. 수컷 생쥐의 나이에 따라 WT 암컷과 교배한 결과, 9～10개월령의 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 WT에 비해 생식력이 유의적으로 낮았다. ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐를 이용한 본 연구결과, Leydig cell에서 ERα는 세포의 증식보다는 노화과정에서 세포의 성장에 관여하는 것으로 사료된다. 따라서 Leydig cell에서 ERα의 결함은 세포의 성장을 저해하여 정소의 무게를 감소시키며, 또한 생식력을 저해시키는 것으로 사료된다.

자궁내막에 존재하는 Aquaporins (AQPs)는 수분과 이온, 소분자들의 이동 및 세포의 삼투와 극성유지에 관여하며, 생식기능의 항상성 유지에 매우 중요하다. 본 연구에서는 난소절제술 동물모델과 estrogen receptor alpha (ERα) 적중 생쥐모델을 이용하여 estrogen에 의한 자궁내막 AQPs 발현 조절을 규명하고자 하였다. 8주령 ICR 생쥐 암컷의 발정주기 별 자궁조직을 획득하였고, 난소절제 후 17β-estradiol과 progesterone을 피하주사하여 자궁조직을 획득하였다. 8주령 C57BL/6 ERα 적중 생쥐에서 AQPs 발현분석을 하였으며, 난소 절제술을 수행한 ERα 적중생쥐에 17β-estradiol 주사 후 ERα, ERβ, AQP-2, -4, -5, -8, -9의 발현 변화를 확인하였다. Estrus 시기에서 AQP-4, -5, -8, -9 발현이 증가하였으며, AQP-2는 유의적인 차이가 없었다. 난소절제술 모델에서 E2 처리시 AQP-4, -5, -8, -9 mRNA의 발현이 증가하였고, ERα 적중모델에서 AQP-2 mRNA만이 ERα +/+와 ERα －/－ 모두 발현이 되었을 뿐 다른 AQP들은 발현이 없었다. 난소절제술을 수행한 ERα 적중모델에 E2 처리시 AQP-2만 발현이 되었으며, WT과 차이가 없었다. 기존 연구에서 estrogen에 의해 발현이 증가된다고 보고된 물의 선택적 투과에 관여하는 AQP-2는 ERα에 비의존적으로 발현됨을 확인하였으며, AQP-4, -5, -8, -9은 estrogen에 의해 발현이 조절되는 것으로 사료된다.

세포의 대사과정에서 생성되는 활성산소종(reactive oxygen species : ROS)은 세포의 성숙과 발생 과정을 저해하며, 인간의 생식 수관에서 불임의 원인이 된다. 많은 세포생물학적 연구를 통해 ROS에 대한 세포 내의 보호 기작이 밝혀지고 있다. Activating transcription factor 4(ATF4)는 세포 내에서 산화적 스트레스를 비롯한 여러 스트레스 요인으로부터 세포를 보호하는 기작에 관여하는 중요한 인자로서, 스트레스