This study was conducted to analyze the transgenic efficiency and sex ratio in -1,3-galactosyltransferase (GalT) knock-out (KO) transgenic pigs according to generation. GalT KO piglets were produced by artificial insemination or natural mating. The transgenic confirmation of GalT KO was evaluated by PCR amplification using specific primers. After electrophoresis, three types of bands were detected such as 2.3 kb single band (Wild), 2.3 and 3.6kb double bands (GalT KO -/+; heterozygote), and 3.6kb single band (GalT KO -/-; homozygote). Transgenic efficiency in F1 generation was 64.5% (23/35) of GalT KO (-/+). In F2 generation, GalT KO transgenic efficiency was 36.4% (21/57, Wild), 47.5% (28/57, GalT KO -/+), and 16.1% (8/57, GalT KO -/-), respectively. Interestingly, no homozygote piglets were born in 6 deliveries among total 11 deliveries, although they were pregnant between male (M) and female (F) heterozygote. In the 5 litters including at least one GalT KO -/- piglet, the transgenic efficiency was 13.3% (2/24, Wild), 51.3% (14/24, GalT KO -/+), and 35.3% (8/24, GalT KO -/-), respectively. The sex ratio of M and F was 40:60 in and 49:51 in generation, respectively. Based on these results, GalT KO transgenic pigs have had a reproductive ability with a normal range of transgenic efficiency and sex ratio.

Sialic acid는 9탄당의 단당류로 당단백질이나 당지질의 당사슬 말단에 존재한다. Sialyltransferase의 활성에 따른 sialic acid의 함량의 변화는 세포의 생존, 분화, 증식등 다양한 방면으로 영향을 미치며 대표적인 당단백질 의약품인 EPO의 경우 말단 sialic acid의 함량은 체내활성이나 반감기와 밀접한 관련이 있다. 따라서 sialytransferase는 다 양한 방면의 연구에서 중요한 효소 중 하나이다. 하지만 돼지에서는 당사슬 관련 연구가 미흡하며 관련 효소들도 아직까지 그 염기서열이나 세포내 기능이 명확하게 알려지지 않 았다. 따라서 이번 연구에서는 기존에 클로닝 된 ST6Gal1을 돼지유래 세포주 PK-15세포 를 이용하여 세포내 기능을 분석하였고, ST6Gal1 단백질의 발현량을 각 조직별로 비교분 석하였다. N-terminal 구역에 Flag-tagging된 pig ST6Gal1을 pcDNA3.1(+) vector에 cloning하여 PK-15 cell에 trasfection하였다. Rea-time PCR과 Western blot을 이용해 효소의 발현을 확인한 후, α2-6 sialic acid를 특이적으로 인지하는 Sambucus nigra agglutinin (SNA)을 사용하여 immunofluoresescence microscopy analysis를 수행하였다. 그 결과, ST6Gal1-transfected cell에서 α2-6 sialic acid의 증가를 간접적으로 확인할 수 있었다. 또 한, adhesion assay를 통해 ECM 기질의 일종인 fibronectin에 대한 부착력이 증가함을 알 수 있었다. 이는 PK-15 cell의 β-integrin에 존재하는 당사슬의 α2-6 sialic acid 함량의 증가와 연관이 있는 것으로 생각되어 진다. 조직별 발현량 분석을 통해서는 간에서 특이 적으로 높은 발현을 보였으며 이는 human, mouse 등의 다른 종들에서의 결과와도 일치 한다. 또한, 자돈(5일)보다는 성돈(24개월령)에서 ST6Gal1의 발현량이 전체적으로 높게 관찰되었다.

This study was conducted to examine the effect of oocyte donor age and micromanipulation medium on the development of mouse cloned embryos receiving cumulus cells. Mouse oocytes were obtained from 6 to 11 week-old mice BDF1 female mice(experiment 1) and cumulus cells were used as donor cells. Micromanipulation procedures for nuclear transfer(NT) were performed in FHM, M2 or Hepes-buffered TCM199(TCM199) medium(experiment 2). After nuclear transfer, the reconstructed oocytes were activated by 10 mM SrCl2 in Ca-free CZB medium in the presence of 5 μg/ml cytochalasin B for 5 h and cultured in KSOM medium for 4 days. In experiment 1, the survival rate of oocytes after injection of cumulus cells were significantly(p<0.05) lower in oocytes from 6～7 week-old mice(53.3%) than in oocytes from 8～9(80.9%) and 10～11 week-old mice(77.1%). In experiment 2, the survival rate of oocytes after cell injection were significantly(p<0.05) higher in FHM and M2 medium(71.7% and 76.9%) than in TCM199 medium (51.2%). The activation rates of cloned embryos were not different among the micromanipulation media. However, the embryos developed to blastocyst stage were significantly(p<0.05) higher in FHM medium(13.9%) than in M2 and TCM199 medium(0.0% and 0.0%). In conclusion, the present study suggest that oocytes from above 8 week-old mice are superior to oocytes from 6～7 week-old mice as a source of recipient cytoplasm and FHM is superior to M2 and TCM199 as a micromanipulation medium for mouse somatic cell cloning.

The overexpression of Phosphoprotein Enriched in Astrocytes (PEA15) gene is commonly found in human diabetic patients. The overexpression of this gene in skeletal muscle and fat tissues have been reported to cause insulin resistance, thereby impairing insulin stimulated glucose uptake. We introduced a gene of mouse PEA15 (mPEA15) and enhanced green fluorescent protein (EGFP) into fertilized one cell pig zygotes using microinjection, and produced a piglet that showed overexpression of mPEA15 in the muscle tissues and expression of EGFP in the ear tissues and hooves. RT-PCR RFLP, southern blot and FISH analysis showed that the tissues carried the transgene. Real-time RT-PCR and western blots demonstrated that PEA15 gene was overexpressed in the various tissues and muscle tissues, respectively. These facts suggest that expression vector system is normally expressed in the trnasgenic (TG) pigs. To use as animal diseases model for type 2 diabetes, further study is necessary to confirm whether diabetes occur in these TG pigs, especially insulin resistance.

This study was conducted to investigate the effects of donor cell treatments on the production of transgenic cloned piglets. Ear fibroblast cell obtained from NIH MHC Inbred minipig was used as control. The GalT knock-out/CD46 knock-in (GalT/CD46) transgenic cell lines were established and used as donor cells. The reconstructed GalT/CD46 embryos were surgically transferred into oviduct of naturally cycling surrogate sows (Landrace × Yorkshire) on the second day of standing estrus. Unlike control (1.2 kV/cm,, 75.4%), the fusion rate of the GalT/CD46 donor cells was significantly higher in 1.5 kV/cm, (84.5%) than that of 1.25 kV/cm, (20.2%) (p<0.01). When the number of the transferred embryos were more than 129, the pregnancy and delivery rates were increased to 13/20 (65%) and 5/20 (25%) compared to less than 100 group [1/6 (16.7%) and 0/6 (0%)], respectively. To analyze the effect of donor cell culture condition on pregnancy and delivery rates, the GalT/CD46 donor cells were cultured with DMEM or serum reduced medium. In serum reduced medium group, the pregnancy and delivery rates were improved to 8/12 (66.7%) and 5/12 (41.7%) compared to DMEM group [3/7 (42.9%) and 0/7 (0%)], respectively. In conclusion, it can be postulated that an appropriate fusion condition and culture system is essential factors to increase the efficiency of the production of transgenic cloned piglets.

형질 전환 동물 생산에는 조직 및 시기 특이적 발현 조절이 가능하다는 장점 때문에 유즙 내로 외부 유전자를 발현시키는 시스템이 널리 이용되고 있다. 유전자 발현 즉, 단백질 생산은 프로모터의 강도뿐만 아니라 mRNA의 안정성에 의해서도 조절된다. 특히, polyadenylation에 의한 poly A의 길이는 in vivo와 올 in vitro에서 mRNA 안정성 및 목적 유전자의 번역효율에 영향을 준다. 본 연구에서는 이러한 mRNA 안정성이 목적 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 3'-UTR 염기 서열을 분석하였다. 이 3'-untranslated region(UTR) 내의 poly A signal을 기준으로 putative cytoplasmic polyadenylation element(CPE) 부위와 downstream elements(DSE: U-rich, G-rich, GU-rich)의 염기 서열을 분석하고, 각각의 element를 기준으로 15 종의 luciferase reporter vector를 제작하여, 생쥐 유선 세포주(HC11)와 돼지 유선 세포주(PMGC)에 각각 transfection시킨 후 48시간 동안 배양하고 luciferase 발현량을 분석하였다. PMGC의 경우, luciferase의 발현은 exon 9의 CPE 2,3 및 DSE 1을 포함한 #6 construct에서 유의적으로 높은 발현량을 보였으며, exon 9의 CPE 2, 3과 DSE를 모두 포함하고 있는 #11 construct에서도 유의적으로 높은 발현량을 보였다. 이러한 결과는 형질 전환 돼지 생산에 있어 #6 및 11 construct의 사용은 목적의 유전자를 효과적으로 발현시키는데 기여할 것으로 사료된다.

조혈 줄기 세포에의 효과적인 유전자 전달은 유전자 치료의 새로운 가능성을 제시할 수 있다. 레트로바이러스를 이용한 유전자 전달 기술은 많은 기초 연구와 임상 시도가 이루어진 대표적인 바이러스이다. 그러나 현재 사용되고 있는 in vitro에서의 조혈 줄기 세포에의 유전자 도입은 조혈 줄기 세포의 분화 유도, 자기 복제 능력과homing 능력의 저하 등 많은 문제점이 있다. 본 연구는 이러한 문제점을 극복하기 위한 방법으로서 마우스의 대퇴골에 직접 레트로바이러스를 이식하는 IBM (Intra-Bone Marrow) 방법을 이용하여 조혈 줄기 세포에의 효과적인 유전자 도입을 시도하였다. IBM 이식 2주 후 마우스의 각 조직을 분석한 결과, 골수뿐 아니라 림파절, 비장, 간장 세포 등에서 유전자가 안정적으로 발현하는 것을 관찰하였다. 또한, 6.4+-2.7%의 골수조직 존재 조혈줄기/전구세포에서 도입된 유전자가 안정적으로 발현하고 있는 사실을 확인하였다. 본 연구의 결과를 바탕으로 IBM 이식 방법을 이용한 생체 조직 내 레트로바이러스의 유전자 도입은 조혈 줄기 세포를 이용한 유전자 치료에 매우 효과적인 방법이라는 사실을 시사해주고 있다.

본 연구는 돼지 골수에서 존재하는 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 이용해 이종 동물 모델인 태아 마우스 복강 생체 이식을 통하여 돼지 조혈 세포의 이종 조혈 조직에서의 증식과 분화 특성을 규명하였다. 선천성 면역 부전 마우스인 NOD/SCID 마우스 태아 조혈 환경에 돼지 골수 유래 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 이식하고, 이식 후 5주령에 마우스 조혈기관에서의 돼지 조혈 세포의 증식과 분화 특성을 돼지 특이적 항체 면역 염색으로 유세포 분석을 실시한 결과, 마우스 조혈 조직인 골수, 흉선, 간장, 비장 및 림파절에서 돼지 조혈 세포의 분화 및 증식이 관찰되었다. 특히 돼지의 T 면역세포가 골수계 세포에 비해서 높은 chimerism이 관찰되어 태생 초기의 NOD/SCID 조혈 환경에 의한 특이적 T 면역세포의 증식에 적합한 조혈 환경을 제공하고 있다는 사실이 밝혀졌다. 본 마우스 신생 NOSD/SCID 복강 이식 동물 모델을 이용해 돼지 T 면역세포의 분화 발달 연구 및 이종 장기 이식 기전 연구에 좋은 모델로서 활용이 기대된다.