소의 수정란 생산과 이식에 대한 연구는 한우의 개량과 증식 그리고 한우 유전자원의 안정적인 관리로 산업적 활용성을 증대 시킬 수 있다. 따라서 본 연구에서는 한우의 생체 에서 난포란을 채란에 따른 효율성을 높이기 위해서 연구를 수행하였다. 생체난포란 채란 을 위한 한우 공란우는 한우연구소에서 사육중인 한우에서 실시하였다. 생체 내 난포란의 관찰은 MyLabTM30VETGOLD(Esaote, Genova, ITALY) 및 탐촉자(EC123; Micro-Convex 9∼3 MHz, Esaote, Genova, ITALY)는 6.6 MHz convex scanner를 사용하였고, 난포란 채란에 사용된 주사침은 19G 주사침을 사용하였다. Monitor Image에 고정된 2 mm 이상 의 난포에서 난포의 수량을 확인하고 난포란을 흡인하였다. 흡입된 난포란은 2∼3회 washing으로 혈액 등의 이물질을 제거하여 실체현미경 하에서 회수하였고, 난포란의 등 급분류는 세포질 균일도와 난구세포의 부착 정도에 따라 평가기준을 1등급에서 3등급까 지 분류하였다. 회수된 난포란의 체외성숙배양은 TCM 199 기본배양액에 소 태아혈청(Fetal Bovine Serum) 0.5%와 LH, FSH, FGF, EGF 첨가하여 22시간 동안 배양하였고, 체외수정은 IVF 100(IFP, Japan) 배양액 50μl 미소적에 성숙 난포란 20개씩 넣어서 체외수정을 실시 하였다. 체외수정을 위해서 KPN 동결정액을 사용하였고 수정을 위한 정자의 최종 농도 는 2x106/ml로 6시간 동안 체외수정을 유도하였다. 체외배양은 조건은 5% O2, 5% CO2, 그리고 90% N2 와 38.5°C 인큐베이터에서 배양하였다. 수정율은 체외수정 후 48시간째 확인하였고 배반포 수정란 발달율은 체외수정 후 192시간째 확인하였다. 농후사료 급여량 에 따른 난포란의 회수효율은 2.0kg/일 급여시 초음파상에서 채취가능 난포란은 9.6개, 3.0kg일 때는 8.8개로서 유의적인 차이는 없었으나, 2.0kg 급여시에 다소 높은 난포란을 확인하였다. 생체 채취된 난포란의 체외배양에 따른 수정란의 발달율은 IVD 배양액에서 15.6%, CR1aa 26.2%, SOF 37.1% 발달율로서 IVD 배양액보다 SOF 배양액에서 유의적 으로(P<0.05) 높은 발달율을 보였다. 배양액 종류에 따른 동결 융해후의 생존율은 66.7%, 64.7%, 70% 각각 나타내었다. 생체난포란을 활용한 수정란이식을 위해서 체외배양시스템 의 안정적인 시스템 구축이 필요하며 생체채취 난포란의 회수를 위한 시술자의 기술적인 숙련도가 상승되었을 때 효율성을 제고할 수 있을 것으로 시료된다.

소 바이러스성 설사병(BVD)은 바이러스 감염에 의하여 발생하는 소의 전염병으로 소 화관 점막의 궤양과 설사, 호흡기 병변 등을 유발하며 심할 경우에는 폐사를 일으키는 질 병이다. 본 질병의 원인체는 Flaviviridae의 pestivirus속으로 분류되는 RNA 바이러스로 일반적으로 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV) 라고 부른다. 본 질병의 대표적인 임 상증상은 설사를 나타내지만 기침 콧물 등 호흡기증상과 구강점막의 궤양 상피세포 탈락 등을 나타낼 수 있으며, 임신한 소에서는 유산과 사산을 일으키거나 선천성 기형우와 허 약우 분만을 야기하기도 한다. 따라서 전 세계적으로 BVDV 감염에 의한 피해가 보고되 고 있다. 따라서 본 연구에서는 한우 BVD 예방을 위하여 분만예정우에 BVDV 혼합백신 접종과 분만 후 송아지에 초유로 이행한 백신접종 이행항체 특성, 그리고 신생송아지의 백신접종에 따른 항체 형성을 확인해 보았다. 임신한우 28두에 분만 예정일 6주 전 BVDV 혼합백신(CattlemasterⓇ 4, Zoetis, U.S.A)를 접종과 동시에 채혈을 하였고 이후 분만 3주 전 채혈하였다. 예방접종한 임신우에서 태어난 신생송아지 28두에서 분만 6시간 이내, 48시간, 1주, 4주, 8주, 12주, 16주 20주, 24주, 28주 32주 채혈을 하였다. 또한 28두 신생송아지에서 8주와 12주에는 채혈과 동시에 BVDV 백신을 접종하였다. 채혈 혈청의 BVDV 항체 분석(BVDV Antibody Test Kit, IDEXX, U.S.A)결과 분만 후 48시간에 가 장 높은 항체역가를 나타내었고 20주까지 지속적으로 감소하다가 24주에 소폭 상승을 나타내었다. 8주 12주 백신접종과 상관없이 20주까지 지속적인 항체가 감소 확인 후, 백 신접종 적정시기를 확인해 보기 위하여 총 61두의 신생송아지에 20주에서 32주까지 4주 간격으로 백신접종을 하였다. 처리1) 15두에 BVDV 백신을 분만 20주에 1차, 24주에 2 차 접종과 채혈 후 28주에 채혈을 하였다. 처리2) 16두에 24주에 1차, 28주에 2차 백신 접종과 채혈 후 32주에 채혈을 하였다. 처리3) 15두에는 28주에 1차, 32주에 2차 백신접 종과 채혈 후 36주에 채혈을 하였다. 처리4) 15두에는 32주에 1차, 36주에 2차 백신접종 과 채혈 후 40주에 채혈을 하였다. 채혈혈액 항체분석 결과 1∼2차 백신접종 후 4주까지 지속적인 항체 감소는 처리1에서 3두, 처리2에서 5두, 처리3에서 3두, 처리4에서 0두로 나타났다.

The study aims to assess the embryo development and survivability of bovine embryos cultured in vitro by addition of cysteine. The rates of metaphase II formation are not significantly different among the three groups(73.8% for TCM199, 76.9% for TCM199 with 0.3mM cysteine and 83.8% for TCM199 with 0.5mM cysteine). No differences on cleavage rate(70.6~74.6%) was observed among three culture medium(70.6% for TCM199, 71.3% for CR1aa, and 74.6% for SOF) with 0.5mM cysteine. However, significantly(P<0.05) higher development rate was obtained in the blastocyst stage by adding 0.5mM cysteine in SOF medium(35.6%) than in TCM199(27.6%) or CR1aa(26.6%). No significant differences in the cleavage rates were observed among the three culture. After freezing the blastocysts cultured with 0.5M cysteine, the re-expansion rates ranged from 61.3% to 86.4% among groups, and hatching rates are from 26.3% to 46.9% among groups. The rates of re-expansion and hatching are significantly(P<0.05) higher in SOF medium(86.4% and 46.9%, respectively) than those in TCM199(61.3% and 26.3%) and CR1aa medium(87.1 and 44.4%). After thawing, the blastocyst re-expansion rate become significantly(P<0.05) higher in in vivo (87.1%) and in vitro (70.3%) embryos. In conclusion, our results demonstrate that supplementation of IVM and IVC media with 0.5mM cysteine improved the quality of in vitro production of embryo and post-thawed embryo. Future studies comparing these culture systems in well-designed trials should be performed.

The bovine fatty acid binding protein 4 and 5 (FABP4 and 5) is a major positional and physiological candidate gene for the bovine marbling and carcass weight. The aim of this study was to evaluate the association between economic traits of Korean cattle (Hanwoo) and genetic variation in fatty acid binding protein 4 and 5 (FABP4 and 5) genes within carcass/meat quality traits and the before/after of fatting in breed Hanwoo. Here, we characterized the nucleotide polymorphism of FABP4 and 5 in 86 cattle. We were detected the variability of three types (GG, AG, and AA) by PCR, and economic traits were analyzed by the mixed regression model implemented in the ASReml program. As the result of statistical and supersonic analysis, FABP4 gene was highly showed significant effect (p<0.006) on marbling score (MS), in contrast FABP5 gene was lowed (p<0.084) on MS before fatting. But, FABP4 gene was highly showed significant effect (p<0.0054) on MS, in contrast FABP5 gene lowest (p<0.0899) on MS in the after of fatting. Compare to supersonic result before fatting in FABP4 gene, it was detected type GG: (p<7.18), AG: (p<8.50), and AA: (p<10.50) (n=50), showed type GG: (p<4.88), AG: (p<2.33), and AA: (p<0.00) after weed out (n=20). Futhermore, it was detected type GG: (p<9.30), AG: (p<7.95), and AA: (p<7.40) (n=50) before fatting in the FABP5 gene. It was shown type GG: (p<2.67), AG: (p<3.50), and AA: (p<5.00) after weed out (n=50). Our results indicate that FABP4 and 5 gene transcription is regulated by the environment of feeding and management, and suggest that feeding and management could be potential key in determining FABP4 and 5 genes transcription for carcass/meat quality traits in breed Hanwoo.

This study was carried out to investigate effective condition for producing somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos of Jeju native cattle. As donor cells for SCNT, ear skin cells from Jeju native cattle were used. In experiment 1, the effect of recipient oocyte sources on the development of Jeju native cattle SCNT embryos were examined. Fusion rate of recipient oocyte and donor cell was not different between the Hanwoo and Holstein recipient oocytes (86.0% vs 89.9%). The rate of embryos developing to the blastocyst stage was significantly (p<0.05) higher in Hanwoo recipient oocytes than in Holstein recipient ones (28.2% vs 14.7%). Blastocysts derived from Hanwoo recipient oocytes contained higher numbers of total cells than those derived from Holstein ones ( vs ), although there were no significant difference. The mean proportion of apoptotic cells in blastocyst was not different between the sources of recipient oocytes. In experiment 2, the development of Jeju native cattle and Hanwoo SCNT embryos were compared. Hanwoo oocytes were used as the recipient oocytes. Fusion rate was not different between the Jeju native cattle and Hanwoo SCNT embryos (92.1% vs 92.9%). The blastocyst rate of SCNT embryos was significantly (p<0.05) lower in Jeju native cattle than in Hanwoo (16.9% vs 31.0%). Blastocysts derived from Jeju native cattle SCNT embryos contained smaller numbers of total cells than those derived from Hanwoo ones ( vs ), but there were no significant difference. The mean proportion of apoptotic cells in blastocyst was not different between the Jeju native cattle and Hanwoo SCNT embryos. The present study demonstrated that Hanwoo recipient oocytes were more effective in supporting production of Jeju native cattle SCNT embryos, although Jeju native cattle SCNT embryos showed reduced developmental capacity when compared to Hanwoo SCNT embryos.

혈액응고 제 8인자(FVIII)는 혈액 내 존재하는 당단백질의 하나로, 혈액응고의 내인성 기 작에 기능한다. 이러한 FVIII의 결핍은 A형 혈우병을 야기하는 것으로 알려져 있으며, A형 혈우병 환자는 FVIII의 지속적인 주사에 의해 치료되고 있다. 본 연구는 A형 혈우병의 치료 제로써 활용 가능한 B-domain이 변형된 재조합 인간 혈액응고 제 8인자 (dB747)를 유즙으 로 분비하는 형질전환 돼지의 유즙으로부터 크로마토그래피적인 방법으로 dB747의 효율 적 인 정제를 위한 방법을 제공하기 위하여 수행되었다. 연구는 dB747을 유즙으로 발현하는 형질전환 돼지의 유즙을 착유하여 원심분리를 통해 지질과 불순물을 제거하고, 유즙 내 복 합적으로 존재하는 수 많은 단백질을 분획하기 위한 전처리 과정으로써 일반적으로 유즙 단백질을 침전시킨다고 알려진 zinc chloride, calcium chloride와 일반적인 단백질 침전에 널리 이용되는 ammonium sulfate를 농도 별로 처리하여 분획의 정도를 확인하였다. 전처 리 과정을 통해 분획된 유즙을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 방 법으로 정제하였다. 음이온 교환 크로마토그래피는 혈장 유래의 FVIII을 정제하는데 유리하 다고 알려진 Q sepharose FF 컬럼을 이용하여 대표적인 두 가지 sodium acetate와 sodium citrate buffer의 효과를 비교하였다. 또한, 친화 크로마토그래피는 B-domain이 결여된 재조합 인간 혈액응고 제 8인자(BDDrFVIII)을 정제하는데 이용 가능하다고 알려진 펩타이드 TN8.2와 EYHSWEYC를 리간드로 사용한 컬럼을 제작하여 수행하였다. 그 결과, dB747이 포함된 형질전환 돼지의 유즙을 분획하기 위해서는 ammonium sulfate의 연속적인 처리를 통해 포화도 30%의 상층액을 회수하여 포화도 50%가 되도록 ammonium sulfate를 첨가하 였을 때 생성되는 pellet을 이용하는 것이 가장 효율적인 것으로 나타났다. 효율적인 전처리 과정을 거친 유즙을 이용한 크로마토그래피 결과, 혈장 유래의 FVIII의 정제에 대한 이전의 보고와는 다르게 dB747의 회수율과 순도가 낮았다. EYHSWEYC를 이용한 친화 크로마토 그래피의 경우, 알려진 것과는 다르게 dB747과 결합하지 않는 것으로 확인되었으며, TN8.2 를 이용한 친화 크로마토그래피 역시 dB747를 정제하는데 이용하기 어려웠다. 또한, 크로 마토그래피 용출액 내에 20～40 kDa의 단백질이 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 문헌 조사를 통해 카제인으로 유추할 수 있었다. 이러한 결과는 dB747이 B-domain 영역이 변형 되는 과정에서 기존의 FVIII 또는 BDDrFVIII과 단백질의 성질이 달라짐으로써 기존에 알려 진 정제 조건이 알맞지 않기 때문에 회수율과 순도가 낮았던 것으로 사료된다. 따라서 dB747의 성질을 이해하고 최적화된 크로마토그래피 조건을 확립하기 위한 연구가 필요할 것이다. 또한, 카제인과 같은 유즙 단백질이 크로마토그래피 용출액에서 나타나는 것으로 보아, 유즙 단백질은 음이온 교환 크로마토그래피나 친화 크로마토그래피에 의해 제거되지 않음을 확인할 수 있었다. 그러므로 초기 전처리 단계에서 유즙 단백질을 제거하기 위한 방 법의 연구가 유즙 내 목적 단백질을 정제하는데 있어서 중요한 문제가 될 것이다.

본 연구는 핵산가수분해 기능이 있는 항체인 3D8 scFv(single-chain variable fragment) 유전자를 형질전환 닭에서 발현시키고 3D8 scFv 항체의 항-바이러스 기능을 검증하고자 한다. 연구는 in vitro(형질전환 닭유래 세포)와 in vivo(형질전환 닭)로 나누어서 수행하고자 한다. 먼저 닭 태아섬유아세포는 형질전환 닭과 일반 닭을 각각 인공수정을 시킨 후 생산된 10일차 수정란의 태아에서 CEF(Chicken Embryo Fibroblast)를 수집하였다. 3D8 scFv 유전 자가 삽입된 CEF 세포는 항생제(puromycin)를 이용하여 형질전환 세포만을 선발하였다. 그 리고 선발된 CEF 세포는 면역염색을 이용하여 3D8 scFv 유전자가 세포내에서 단백질로 발현됨을 확인하였다. 그리고 선발된 세포들의 항-바이러스 기능 검증은 GFP 유전자로 표 지된 재조합 NDV(Newcastle Disease Virus)를 세포에 직접 감염시키고, 세포내에서 발현 하 는 GFP의 발현량을 FACS를 이용하여 정량하는 방법으로 항-바이러스 기능을 조사하였다. 이들 가운데 항-바이러스 기능이 있을 것으로 예상되는 형질전환 2계통에 대하여 항-바이러스 기능을 검증을 준비하고 있다.

한우 고급육 생산을 위해 종모우의 개량과 선발이 이루어지고 있으나 좀 더 효율적인 개 량을 위해서는 고급육을 생산할 수 있는 한우 암소의 개량이 필수적이다. 따라서 본 연구는 경기도 안성지역 한우의 육질 개량을 위해 지역 한우농가의 소를 대상으로 육질 초음파 측 정과 육질관련 유전자와의 비교 분석을 하기 위해 실시하였다. 육질분석을 위해 3산 이상 한우 번식우 86두를 대상으로 초음파로 등심단면적, 등지방두께, 근내지방을 측정하였다. 각 개체별로 혈액을 채취하여 유전자를 분석하였으며, 유전자 분석은 육질관련 유전자로 알 려진 FABP4와 FABP5-1, FABP5-2를 이용하였다. 개체별로 고급육 생산을 위한 사양관리 전과 사양관리 후 표현형과 유전자와의 상관 관계를 분석하였다. 번식우의 일반 사양관리 조건(비육전)에서 FABP4는 육질초음파 측정 결과와 유전자 분석과의 상관 관계가 0.006으 로 매우 높은 것으로 나타났다. 그러나 FABP5는 상관 관계가 0.084로 비교적 낮은 결과를 보였다. 그러나, 비육후 도축하였을 때 FABP4는 육질초음파 측정 결과와 유전자 분석과의 상관 관계가 0.0054로 매우 높은 것으로 나타났다. 그러나 FABP5는 상관 관계가 0.0899로 비교적 낮은 결과를 보였다. FABP4 유전자에서 비육전 초음파 측정 결과와 비교하였을 때 GG type은 7.18, AG type은 8.50, AA type은 10.50이었으나(n=50), 비육후 도축한 결과 GG type에서 4.88, AG type은 2.33, AA type은 나타나지 않았다(n=20). FABP5 유전자에 서 비육전 초음파 측정 결과와 비교하였을 때, GG type은 9.30, AG type은 7.95, AA type 은 7.40이었으나(n=50), 비육후 도 축결과는 GG type에서 2.67, AG type은 3.50, AA type 5.00으로 나타났다(n=20). 두 가지 유전자에서 비육전과 비육후 유전자와 표현형과의 관계 가 반대로 나타났음을 알 수 있었다. 즉, 이 결과를 통해 육질관련 유전자를 보유하고 있더 라도 비육을 하지 않고 일반 번식우 사양관리를 하였을 때 육질이 떨어진다는 것을 알 수 있었다.

돼지는 인간과 생리적으로 유사하기 때문에 다양한 목적으로 연구되고 있다. 최근에는 돼 지를 이용한 이종장기이식 관련 연구가 큰 주목 받고 있으며, 치료용 단백질을 생산하기 위 한 생체반응기로써 이용되고 있다. 이러한 연구에 있어서 당 사슬의 역할은 매우 중요하다. 당 사슬은 치료용 단백질의 체내 안정성에 큰 영향을 미치며 다양한 방법으로 면역을 조절 한다고 알려져 있다. 하지만 돼지에서의 당 사슬 관련 연구는 미비하며, 많은 당 전이효소 들의 서열이나 기능이 정확히 분석되지 않고 있다. 따라서 이번 연구에서는 당 전이효소 중 하나인 β‐1,3‐N‐acetylglucosaminyltransferase 1 (B3GNT1)을 돼지로부터 동정 후 PK‐15 세 포주를 이용하여 기능분석을 하였다. 이 유전자는 다양한 glycan epitope를 형성하는데 있 어서 중요한 기능을 한다. 먼저 간 조직으로부터 획득된 cDNA를 주형으로 degenerated PCR을 수행하여 유전자를 동정하였다. 동정된 유전자는 368개의 아미노산을 encoding하 는 1227개의 nucleotide로 구성되어 있으며, 다른 종에서 보고된 B3GNT1과 높은 상동성을 가 지고 있는 것을 확인하였다. 또한, 기능 분석을 위하여 돼지 신장세포인 PK‐15에서 B3- GNT1의 과 발현을 유도하였다. RT‐PCR과 Western blot을 통하여 유전자의 과발현을 확인 하고, Lycopersicon esculentum lectin (LEA)를 이용한 ELISA 분석 방법을 통해 효소의 기 능을 확인하였다. B3GNT1은 poly N‐acetylactosamine (polyLacNAc) 형성에 중요한 역할 을 하기 때문에 이를 특이적으로 인지하는 LEA를 사용하였다. 이를 통해 B3GNT1의 과발현이 유도된 세포에서 더 많은 polyLacNAc이 합성되었음을 확인할 수 있었다. 또한, Gal(β1‐ 3)GalNAc structure를 이용한 기질반응을 통해 효소의 기능을 확인하였다. 과발현이 유도 된 세포에서 약 3배 이상의 높은 기질 반응성을 보였으며, 이를 통해 돼지로부터 클로닝 된 B3GNT1의 기능을 확인할 수 있었다. 돼지로부터 당 전이효소를 동정하고 분석하는 연구는 생체반응기로써 돼지를 이용하는 다른 연구에 중요한 기반이 될 것이라고 생각한다

유즙 내에 들어있는 유용 단백질을 분리, 정제하였을 때 예상되는 경제적 가치 때문에 우 리는 유즙 내에 들어있는 재조합 hEPO 단백질을 추출하고 정제하려는 많은 시도를 하고 있다. 이러한 노력에도 불구하고 유즙 내에 들어있는 target 단백질의 정제가 매우 어렵고, 그 순도 역시 20%에 지나지 않는다. 우리는 hEPO 유전자를 가지고 있으며 유선에서 hEPO를 분비하는 형질전환 돼지를 생산 보유하고 있다. 그러나, 이들 형질전환 돼지들은 체내에 도입된 유전자의 발현에 의해 야기되는 적혈구 과다증 그리고 혈소판 감소증과 같 은 순환기의 문제가 유발되고 있다. 명백하게, 이러한 종류의 혈액학적 변화는 장기의 정상 적인 기능을 방해하며 형질전환 돼지의 갑작스런 죽음을 초래한다. 그러므로, 앞서 언급한 문제점들을 해결하기 위한 alternative한 방법이 필요하다. 현재 연구에서, 우리는 외인성 hEPO를 발현하는 돼지에서 비정상의 생리학적 증후에 관해서 실험하였으며 hEPO를 생산 하기 위한 alternative choice로서 형질전환 돼지 유래 세포의 배양 system을 제안하였다. 5마리의 F6 hEPO 형질전환 돼지와 4마리와 대조군으로 일반돼지(랜드레이스)를 국립축 산과학원 동물바이오공학과에서 사육 도축하고 순환 장기를 채취하였다. 형질전환 돼지 순 환기 조직(유선, 신장, 폐, 비장)을 계대 배양 후 hEPO mRNA의 발현을 RT-PCR 방법으로 분석하였다. 또한, 면역조직화학 염색법을 통해서 hEPO 형질전환돼지 순환 장기조직에서 발현되는 hEPO의 발현 양상을 분석한 결과로서 유선, 신장 및 폐 조직에서 hEPO의 발현 이 확인되었으나, hEPO 발현 양상이 모든 형질전환동물 조직에서 발현되는 경향을 보이지 는 않았다. 한편, 세포면역화학 분석법에서는 형질전환돼지 유래 세포의 배양 시 hEPO가 발현되고 있는 양상을 확인하였다. 또한, 형질전환 돼지와 일반돼지의 세포 증식률과 증식 속도는 신장 세포에서는 빠른 증식을 나타낸 반면, 폐와 비장 세포에서는 느린 증식률이 확 인되었다. 배양 후 지속적인 세포 증식과 세포의 생존성을 분석하기 위하여 Apoptosis를 TUNEL과 Annexin V를 이용한 방법으로 조사한 결과, 형질전환돼지 유래의 세포와 일반돼 지의 세포 사이에 유의적 차이는 발견하지 못했다. 이들의 결과들로서 본 연구에서는 형질 전환돼지를 생산하여 유용 단백질을 이용하고자 할 경우, 목적으로 하는 세포 뿐 만 아니라 형질전환가축 유래의 다양한 세포를 이용 할 수 있는 가능성을 시사하고 있다.

체세포 핵이식은 형질전환 복제 동물 생산과 더불어 그에 따른 바이오 신약의 개발, 장기 생산 등 많은 장점이 있지만, 여전히 체세포 핵이식 동물의 생산성은 임신율이 낮고 비정상 적인 개체의 탄생 등의 문제점이 있다. 그 이유 중 하나로 핵이식에 사용되는 공여세포가 다시 수정란으로 돌아가는 과정에서 후생학적 역분화가 불완전하게 이루어지기 때문이다. 본 연구는 체세포가 유도만능 줄기세포로 역분화하는 과정에서 사용되는 리프로그래밍 전 사인자 (Oct4, Klf4, Sox2와 c-Myc, OKS-M)의 도입과 더불어, 후생학적 변형에 관련된 억 제제 trichostatin A(TSA), 5-aza-20-deoxycytidine(5-aza), GSK-3 inhibitor와 MEK inhibitor (2i)가 복제 수정란에 미치는 영향에 대해서 연구하였다. 젖소 귀 세포에 전사인자 Oct4, Klf4, Sox2와 c-Myc을 도입하였고, 배양 시간이 흐름에 따라 세포크기가 작아짐 (11.72± 3.39, 8.42±4.95, p<0.05)을 볼 수 있었으며, RT-PCR을 통하여 8개의 콜로니 중 4개의 콜 로니에서 외인성 유전자를 발견하였다. 리프로그래밍에 관련된 내인성 유전자의 활성을 증 가시키기 위하여 HDAC 억제제인 trichostatin A (20 nM), DNA methyltransferase 억제제인 5-aza-20-deoxycytidine (10 μM), 줄기세포 분화 경로 억제제인 GSK-3 (3 μM) and MEK (1 μM)를 처리하였다. 4개 중 1개의 콜로니에서 내인성 유전자의 활성이 증가됨을 발견하였 다. H3K9/K14의 acetylation 상태는 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 체세포 핵이식의 분 할률에서는 somatic cells이 85.9±8.98%, OKS-M 처리군이 82.0±4.97%, OKS-M을 도입한 체세포에 TSA, 5-aza, 2i 처리군이 각각 88.4±7.89, 75.3±8.10, 74.2±2.90%로 OKS-M과 TSA를 함께 처리하였을 때 가장 높은 분할률을 보였고, 배반포와 상실배기 까지의 발달률 은 somatic cells이 9.6±3.79%, OKS-M 처리군이 12.6±6.54%, OKS-M을 도입한 체세포에 TSA, 5-aza, 2i를 처리하였을 때 각각 11.1±6.87, 20.1±5.89, 9.5±1.53%로 OKS-M과 5- aza 를 함께 처리하였을 때 유의적으로(p<0.05) 가장 높은 발달률을 보였다. 따라서 전사인자의 도입과 후생학적 변형과 관련된 억제제의 처리는 소 복제 수정란의 발달률 향상에 영향을 주는 것으로 나타남에 따라, 앞으로 다양한 억제제와 처리조건에 따 라 복제수정란의 향상을 위한 최적화된 방법을 유도할 필요가 있다.

Sialic acid는 9탄당의 단당류로 당단백질이나 당지질의 당사슬 말단에 존재한다. Sialyltransferase의 활성에 따른 sialic acid의 함량의 변화는 세포의 생존, 분화, 증식등 다양한 방면으로 영향을 미치며 대표적인 당단백질 의약품인 EPO의 경우 말단 sialic acid의 함량은 체내활성이나 반감기와 밀접한 관련이 있다. 따라서 sialytransferase는 다 양한 방면의 연구에서 중요한 효소 중 하나이다. 하지만 돼지에서는 당사슬 관련 연구가 미흡하며 관련 효소들도 아직까지 그 염기서열이나 세포내 기능이 명확하게 알려지지 않 았다. 따라서 이번 연구에서는 기존에 클로닝 된 ST6Gal1을 돼지유래 세포주 PK-15세포 를 이용하여 세포내 기능을 분석하였고, ST6Gal1 단백질의 발현량을 각 조직별로 비교분 석하였다. N-terminal 구역에 Flag-tagging된 pig ST6Gal1을 pcDNA3.1(+) vector에 cloning하여 PK-15 cell에 trasfection하였다. Rea-time PCR과 Western blot을 이용해 효소의 발현을 확인한 후, α2-6 sialic acid를 특이적으로 인지하는 Sambucus nigra agglutinin (SNA)을 사용하여 immunofluoresescence microscopy analysis를 수행하였다. 그 결과, ST6Gal1-transfected cell에서 α2-6 sialic acid의 증가를 간접적으로 확인할 수 있었다. 또 한, adhesion assay를 통해 ECM 기질의 일종인 fibronectin에 대한 부착력이 증가함을 알 수 있었다. 이는 PK-15 cell의 β-integrin에 존재하는 당사슬의 α2-6 sialic acid 함량의 증가와 연관이 있는 것으로 생각되어 진다. 조직별 발현량 분석을 통해서는 간에서 특이 적으로 높은 발현을 보였으며 이는 human, mouse 등의 다른 종들에서의 결과와도 일치 한다. 또한, 자돈(5일)보다는 성돈(24개월령)에서 ST6Gal1의 발현량이 전체적으로 높게 관찰되었다.

The overexpression of Phosphoprotein Enriched in Astrocytes (PEA15) gene is commonly found in human diabetic patients. The overexpression of this gene in skeletal muscle and fat tissues have been reported to cause insulin resistance, thereby impairing insulin stimulated glucose uptake. We introduced a gene of mouse PEA15 (mPEA15) and enhanced green fluorescent protein (EGFP) into fertilized one cell pig zygotes using microinjection, and produced a piglet that showed overexpression of mPEA15 in the muscle tissues and expression of EGFP in the ear tissues and hooves. RT-PCR RFLP, southern blot and FISH analysis showed that the tissues carried the transgene. Real-time RT-PCR and western blots demonstrated that PEA15 gene was overexpressed in the various tissues and muscle tissues, respectively. These facts suggest that expression vector system is normally expressed in the trnasgenic (TG) pigs. To use as animal diseases model for type 2 diabetes, further study is necessary to confirm whether diabetes occur in these TG pigs, especially insulin resistance.

This study was conducted to investigate the effects of donor cell treatments on the production of transgenic cloned piglets. Ear fibroblast cell obtained from NIH MHC Inbred minipig was used as control. The GalT knock-out/CD46 knock-in (GalT/CD46) transgenic cell lines were established and used as donor cells. The reconstructed GalT/CD46 embryos were surgically transferred into oviduct of naturally cycling surrogate sows (Landrace × Yorkshire) on the second day of standing estrus. Unlike control (1.2 kV/cm,, 75.4%), the fusion rate of the GalT/CD46 donor cells was significantly higher in 1.5 kV/cm, (84.5%) than that of 1.25 kV/cm, (20.2%) (p<0.01). When the number of the transferred embryos were more than 129, the pregnancy and delivery rates were increased to 13/20 (65%) and 5/20 (25%) compared to less than 100 group [1/6 (16.7%) and 0/6 (0%)], respectively. To analyze the effect of donor cell culture condition on pregnancy and delivery rates, the GalT/CD46 donor cells were cultured with DMEM or serum reduced medium. In serum reduced medium group, the pregnancy and delivery rates were improved to 8/12 (66.7%) and 5/12 (41.7%) compared to DMEM group [3/7 (42.9%) and 0/7 (0%)], respectively. In conclusion, it can be postulated that an appropriate fusion condition and culture system is essential factors to increase the efficiency of the production of transgenic cloned piglets.