목적: 항균제 polyhexamethylene Biguanide(PHMB), epigallocatechin gallate(EGCG) 및 PHMB/EGCG 혼합물의 각막상피세포(primary human corneal epithelial cells, HCEpiCs)에 대한 급성독성을 평가하고자 하였다. 방법: 각막상피세포를 0.00001~0.005% PHMB, 0.001~5% EGCG 및 0.00005% PHMB/0.05% EGCG 혼합물이 각각 포함된 배양액에서 30분, 60분, 120분 및 240분 동안 배양하였다. 배양한 각막상피세포를 고정한 다음 Draq 5로 염색하고 공초점현미경과 ImageXpress UltraTM를 이용하여 세포형태를 관찰하여 세포 생존율과 세포자살(apoptosis)을 비교하였다. 결과: 배양된 각막상피세포는 0.00005% 이하의 PHMB 농도 및 0.05% 이하의 EGCG 농도에서는 세포 독성이 나타나지 않았다. 0.00005% PHMB/0.05% EGCG 혼합물이 포함된 배양액에서 급성 세포독성은 관찰되지 않았으나 240분 배양시킨 경우에는 손상된 각막상피세포 수가 증가하고 생존 세포의 수는 감소하였다. 결론: 항균 시너지 효과를 갖는다고 보고된 0.00005% PHMB/0.05% EGCG 혼합물의 경우 각막상피세포에 대한 급성독성은 없었으나 만성효과에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

본 연구는 배양 각막 상피세포에 anti - F AS and anti - F AS ligand antibody를 노출시 킨 후 세포고사 메커니즘을 결정하기 위해 시행하였다. 배양각막 상피세포에 antihuman FAS(N-18) goat polyclonal IgG를 50, 200, 500, 1,000 ng/m~ 또는 anti-human FAS ligand(C• 20) goat polyclonal IgG를 500 ng/m~으로 2 일과 4 일 동안 처 리 하였다. 주어진 기간 동안 배양한 후 배양액에 부유한 세포와 부착된 세포를 원심분리와 트립 신 처리 원섬분리를 이용하여 수확하였다. 각막상피세포에 대한 anti - F AS and antiF AS ligand antibody 의 영향을 알아보기 위해 Hoechst 33342 staining과 TUNEL stammg 방법을 이용하여 세포 세포고사 유도를 확인하였다. 세포막 수용체인 FAS protein의 발현을 알아보기 위해 ìmmunocytochemistry 를 시행하였다. anti-FAS antìbody를 처리한 군에서는 대조군에 비해 시간과 농도에 비례하여 후기 세포고사 소 견이 증가하였다. 그러나 anti - F AS ligand antibody를 처리한 군에서는 대조군과 차이 가 거의 없었다. 본 연구의 결과 FAS-FAS ligand system 이 각막상피세포에 발현되었 으며 이는 정상 각막 상피 생리 즉， 세포 탈피에 중요한 기능을 갖는 것으로 사료된다

본 연구는 topoisomerase inhibitors가 배양 각막 상피세포에서 세포고사를 유도하 는지를 조사기 위해 시행하였다. Topoisomerase inhibitors'{l camptothecin과 etoposide 를 제조사의 추천농도로 1-2 일 동안 배양하여 MTT assay를 이용하여 세포독성을 검 정하여 농도틀 정하고 세포고사를 확인하였다 세포고사의 형태적인 특징은 Hoechst 33342 staining, Annexin V - FITC/PI staining, DePsipher assay and CytoDEA TH staining을 이용하여 확인하였고 DNA fragmentation은 TUNEL파 agarose gel 전기 영동으로 확인하였다. Camptothecin 과 etoposide는 농도 의존성으로 세포고사룹 유또 하였는데 각막상피세포에서는 저l 조사의 추천농도보다 낮은 농도에서 세포고사플 유 도하여 다른 세포보다 민감한 것으로 나타났다- 이러한 결파로 볼 때 topOlsomerase l띠1ibitor는 각막상피세포에서 홀륭한 양성 대조군으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

콘택트렌즈 소독제로 쓰이는 H2Û2올 중화용 백긁 판올 이용하여 수회 반복 중화한 용액이 배양 각막상피세포의 Apoptosis룰 유도하는지 여부룹 조사하기 위해 본 연구 를 시행하였다 3% H202(AOSept)를 6시간 동안 9회에 걸쳐 통일 백금 판으로 풍화 한 용액을 배양 각막 상피세포에 배양액의 25% 농도로 1--2 띤 동안 처리하여 처음 중화한 용액과 9번째 중화한 용액음 중심으로 세포독성과 Apoptosis를 조사하였다. 세포똑성은 MTT assay를 이용하였으며 lnverted pþase-contrast microscope로 형 태 를 확얀하고 Toluiclin blue 염 색으로 Apoptotic Cell올 확언하였으며 Hoechst 33342 로 형광 염색하여 Apoptotic Index를 조사하였다. 또한 Annexin V - FITC깨ropiclium Iodide(PDstaíning, DePsipher TM assay. M30 CytoDEATH. TUNEL (TdT-dUTP terminal nick-end labelling) assay를 통해 형태적인 변화될 확인하였다. 생화학적 변 화인 DNA Fragmentation은 Agarose gel electrophoresis룹 사 행하였으며 Fas Antigen 의 발현을 조사하기 위하여‘ Irnmunocytochemistry와 Westem blotting올 시 행하 였다. H20z의 독성올 약화시키기 위해 사용되는 백금 판을 수회 재사용하여 중화한 용액닫 25% 농도로 1-2 일간 처리하였을 때 각막 상피세포의 Apoptosis가 유도되는 것 이 형 광 염 색， DNA ladder. Irnmunocytochemistry. Westem blotting등의 방법 으로 확인되었다. 따라서 중화된 H써2룹 25% 농도로 1-2 일 동안 처리한 결과， 세포 증식 저해와 Apoptosis 가 유도되므로 중화용 백금 판의 이용 횟수활 세한하거나 중화시간 을 증가시킬 필요가 있는 것으로 사료된다. 또한 완전하게 중화된 소독용 H202는 더 이상 소독효파가 없으므로 장시간 동안 렌즈의 소쪽보관 용액으로 사용해서는 안 된 다는 교육이 반드시 펼요할 것으로 판단된다.

One-step System으로 6시간 동안 중화된 H202의 배양 각막상피 세포에 대한 세 포독성과 Apoptosis를 조사하기 위해 세포에 15분간 직접 처리하여 세포의 형태적 변화， 생화화적 변화 그리고 면역화학적 발현 여부 등올 확인하였다. 세포독성은 형 태적 변화와 MTT Assay률 시행하였고 Apoptosis는 Hoechst 잃342의 형광염색으로 산 정 한 Apoptotic index, DePsipher™ assay를 이 용한 mitochondria 활성 과 변화를 확인하였으며 immunocytochemistry로 각막 상피세포 막의 수용체인 FAS 의 발현 여 부도 조사하였다. 중화된 H202를 15분간 처리 후 세포독성을 조사한 결과， 같은 디스크로 중화를 반 복한 경우 독성이 높게 나타났으며 세포증식도 느리게 나타났다.24시간 동안 세포를 정상 배양액으로 환원시켜 조사한 결과， 세포 독성에서 회복효과가 거의 없고 Apoptotic index도 높게 나타났다. 또한 미토콘드리아 활성과 초기 Apoptosis 에 대 한 검증도 모두 양성으로 나타났다. 그리고 Apoptosis 유도의 가장 중요한 경로인 FAS-FAS ligand system에 대 한 조사에 서 중화된 H20z를 처 리 한 세 포의 FAS 가 정 싱세포에서 보다 강하게 발현되는 것을 immunocytochemistry로 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 강력한 apoptosis 유도 물질인 H202를 콘태트렌즈 소독을 위해 One-step system으로 중화한 경우에도 불완전하게 중화된 Hz02에 의해 각막상피세 포의 Apoptosis가 유도되 므로 중화용 백금 디 스크의 반복된 사용올 금지 하거 나 반복 사용 시에는 시간을 더 늘려야 할 것으로 사료된다.

4 악 상피세포는 계속해서 탈락하고 세포고사 (Apoptosis) 가 이 과정에 중요한 역 할윤 한다. 본 연구는 콘택프렌즈 착용으로 인한 각막의 부작용에 관여하는 Cytokine 증 어느 Cytokine 이 각막 상피세포의 세포고사를 유도하는지 조사하고자 시행하였다. 각딱 상피세포를 배양하여 4 종류의 인터루킨 OL-1a， IL-1,8, IL-6, IL-H) 과 인터 폐한 감마(l FNr) 그러고 종양괴사 인자 (TNFa‘ TNF，8)를 10 nM, 100 nM, 1μM 농도 포 2. 1, 7 일 동 안 처 리 하였 다. Hoechst :13342 형 광염 색 . Annexin V - FITC/Propi - dium Iodide( Pl) 염 색. TUNEL assay 그퍼 고 DNA Laddering을 시 행 하였 다. IL -la, IL .- 1,8. IL - G. IL - 8는 세 끊파사가 거 의 유도뇌 지 않았고 TNFa, TNF，8는 고농도에 서 약간의 세포고사룹 유도하였으며 IFNr에서는 10nM 에 4 일 동안 노출시 세포고사 가 유도되기 시작하였으며 농도와 노출기간에 비례하여 세포고사 빈도가 높아졌다. IFN -r는 콘택프렌즈로 인한 외상. 감염. 염증이 있을 때 방출되는데 각막상피 세포 고사와 각막병리에 관련이 있는 것으로 사료되며 각막상피세포의 항상성 유지에 중 요한 역할을 하는 것으로 생각된다.