In this study, we investigated the possibility of using mouse embryonic stem cell conditioned medium (ESCM) and embryonic stem cell medium (ESM) for in vitro maturation in the efficient in vitro production of blastocysts from porcine follicular oocyte. Depending on the concentration of supplement of ESCM added to the NCSU-23 solution did not affect 2-cell development rates and blastocysts development. However, in particular, the survival rate (10 days of culture) of blastocyst was significantly higher than that of the control group as the additive concentration (30%) increased (p < 0.05). The survival rate of blastocysts showed a similar tendency even with addition of ESM (30%) alone. On the other hand, the duration of the addition of these additives during IVM (0-44 h) was that the IVM I period (0-22 h) were more effective than the IVM II period (22-44 h). Thus, the effect of these additives is probably due to the combination of the various physiologically active substances of ESCM or the appropriate amino acids and vitamins of ESM. In particular, these additives were more effective during the first half (IVM I) of in vitro maturation. In summary, optimization of ESCM or ESM supplementation may improve in vitro maturation of porcine oocyte and affect developmental competency. Therefore, if more efficient methods of adding ESCM or ESM to basal culture medium can be developed during in vitro maturation of porcine follicle oocytes, high quality blastocysts will be developed from low porcine follicular oocyte compared to other domestic animals.
Hyaluronan은 난포액, 나팔관과 자궁에 존재하는 물질로 돼지의 다정자 수정을 억제하고 체외배 양액에 첨가시 배 발육을 향상시키는 것으로 알려져 있다. Glucuronic acid와 N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)은 이중결합하여 hyaluronan을 구성하는 물질이다. 본 연구에서는 체외성숙 배양액 내 Glucuronic acid 및 GlcNAc 첨가가 돼지 난자의 성숙 및 단위발생 난자의 배 발육에 미치는 영향 을 조사하였다. 난자의 체외성숙 배양액으로는 0.1% PVA (polyvinyl alcohol)가 첨가된 Medium-199 을 기본배양액으로 이용하였고, 여기에 cysteine, pyruvate, epidermal growth factor, kanamycin, insulin 및 호르몬을 추가하여 44시간 동안 난자를 배양하여 체외성숙을 유도하였다. 실험설계에 따라 glucuronic acid 및 GlcNAc를 각각 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1 mM의 농도로 체외성숙 배양액에 첨가 하였다. 체외성숙된 난자는 전기자극을 통해 단위발생을 유도하였고 porcine zygote medium-3에서 7일간 체외 배양하였다. 실험 결과 난자의 체외성숙 배양액 내 glucuronic acid 첨가는 난자의 핵 성숙률(91.3-94.4%), 단위발생 후 분할률(85.5-93.6%) 및 배반포 발달율(42.0-51.0%)에 영향을 미치지 않았으나 배반포 세포수는 0.05 mM glucuronic acid 첨가 군에서 38.0개로 대조군의 31.5개에 비해 유의적으로(P<0.05) 증가하였다. 난자의 체외 성숙 배양액에 GlcNAc를 첨가하였을 때 난자의 핵 성숙률(94.3-97.2%) 및 단위발생 후 배반포 세포수(40.0-43.1)는 대조군 및 첨가 농도의 차이에 따라 유의적인 차이를 보이지 않았으나 분할률은 0.05 mM 처리군에서 91.8%로 대조군(85.0%) 및 0.005 mM 처리군(84.6%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다. 또한 0.05 mM 처리군의 배반포 발달 율은 59.6%로 대조군(46.3%), 0.005 mM 처리군(44.3%) 및 0.1 mM 처리군(45.2%)에 비해 유의적으 로 높았다. 이상 결과로 보아 체외성숙 배야액 내 0.05 mM glucuronic acid 및 GlcNAc 첨가는 돼 지 난자의 단위발생 후 배 발육을 증가시키는 것으로 사료된다.
Monosodium glutamate (MSG)는 아미노산의 일종인 글루탐산에 나트륨이 결합된 것으로 구수한 맛, 감칠맛을 내는 인공조미료로 사용되고 있다. 이전 연구에 의하면 쥐에서MSG의 섭취가 난모세 포의 발달에 유해하다는 결과가 보고되었다. 본 연구에서는 돼지 난자의 체외성숙 및 체외 배양액 에 MSG 첨가가 난자의 성숙 및 배 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 난자의 체외성숙배양액으 로는 10% 돼지 난포액이 첨가된 Medium-199 (positivecontrol) 또는 비필수아미노산이 제거된 Porcine zygote medium (PZM)-4를 기본배양액으로 하여 여기에 cysteine, pyruvate, epidermal growth factor, kanamycin, insulin 및 호르몬을 첨가하여 사용하였다. 실험설계에 따라 MSG를 각각 0, 0.1, 1, 10 mM 농도로 체외성숙 배양액에 첨가하였다. 체외성숙 난자는 전기자극을 통해 단위발생을 유도하였고 PZM-3배양액에서 7일간 체외 배양하였다. 체외배양에서의 MSG 효과를 알아보기 위하 여 돼지 난포액 첨가 Medium-199에서 체외성숙된 난자들 중 제1극체가 방출된 난자만을 선별하여 단위발생 유도 후 PZM-3 (positive control) 또는 비필수아미노산이 제거된 PZM-4에 0,0.1, 1, 10 mM의 MSG를 첨가하여 배 발육에 미치는 영향을 조사하였다. 체외성숙 단계에서 MSG 효과를 조 사한 결과 MSG 농도에 따른 체외성숙률(61.3-70.3%)에는 차이를 보이지 않았지만 10 mM의 MSG 처리군(83.5%)이 0.1 mM 처리군(93.7%)에 비해 유의적으로 낮은 분할률을 보였다. 또한 MSG 처리 군들이 (14.5-25.5%) 무처리군(30.0%)에 비해 낮은(P<0.05) 배반포 발달률을 보였다. 체외배양 단계 에서 MSG 효과를 조사한 결과 10mM MSG 처리군(90.8%)이 1 mM 처리군(96.5%)에 비해 유의적 으로 낮은 분할률을 보였으며, 10 mM 처리군(32.8%)이 0.1과 1 mM MSG 처리군에(55.1, 51.4%)에 비해 유의적으로(P<0.05) 낮은 배반포 발달률 보였으나 무처리 대조군(46.6%)과 유의적 차이는 없 었다. 이러한 결과를 보아 체외성숙 배양액 내 MSG 첨가는 난자의 핵 성숙률에는 영향을 주지 않지만 고농도의 MSG 처리는 단위발생 후 분할률을 억제하며 배반포 발육능을 억제하는 것으로 확인되었다.
돼지 난자의 체외배양 과정에서 배양액의 삼투압의 차이 및 glycine과 alanine 단독 또는 병행 첨 가가 단위발생 및 체세포 핵이식 난자의 배 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 난자 의 체외성숙 에는 10% 돼지 난포액, cysteine, pyruvate, epidermal growth factor, kanamycin, insulin이 첨가된 TCM-199을 이용하였다. 체외성숙 42∼44시간 후 제1극체가 방출된 난자만을 선별하여 단위발생 및 체세포 핵이식 난자를 생산한 후 modified porcine zygote medium (mPZM)-3 배양액에서 7일간 배양하였다. 실험 설계에 따라 체외배양 7일 또는 체외배양 초기 48시간 동안 280 또는 320 mOsm의 삼투압에서 난자를 배양하였다. 실험1에서 체외배양 7일 동안 280 또는 320 mOsm의 배 양액 내 glycine 또는 alanine 첨가 효과를 검토한 결과 삼투압 차이에 따른 분할률 및 배반포 발달 률에는 차이를 보이지 않았으나 320 mOsm에서 배양된 난자 및 280 mOsm에 glycine을 첨가한 군 은 280 mOsm에서 배양된 난자에 비해 높은 배반포 세포수를 보였다 (36.5-38.0 vs. 31.1, P<0.05). 실험2에서는 체외배양 초기 48시간 동안 280 또는 320 mOsm의 삼투압에서 배양하였고, 그 후 280 mOsm 배양액으로 옮겨 5일간 추가로 배양하였다. 또한 체외배양액 내 4.1 mM glycine 첨가가 배 발육에 미치는 효과를 검토하였다. 단위발생 난자를 배양초기 48시간 동안 320 mOsm에서 glycine이 첨가된 배양액에서 배양한 군이 280 mOsm에서 배양한 군에 비해 유의적으로 높은 배반 포 발달율을 보였다(36.5-50.4% vs. 25.9-27.9%, P<0.05). 또한 배양 초기 48시간 동안 320 mOsm 배 양액에 glycine을 첨가하여 배양한 난자 (50.4%)가 다른 처리군의 난자(25.9-36.5%)에 비해 유의적 으로 높은 배반포 발달율을 보였다(P<0.05). 실험3에서는 실험2와 동일한 실험설계로 체세포 핵이 식으로 작성된 배반 포의 inner cell mass (ICM)와 trophectoderm (TE) 세포수를 조사하였다. 실험결과 초기 46시간 동안 glycine이 첨가된 320 mOsm 처리군에서 배양된 난자의 ICM 비율이(26.0%) 280 mOsm 삼투압에 glycine을 첨가한 군(17.8%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다. 본 연구결과 단위 생식 및 체세포 핵이식 난자의 체외배양에서 glycine의 첨가 및 체외 배양초기 48시간 동안 320 mOsm 삼투압 처리는 배 발육과 배반포 세포수를 증가시키는 것으로 확인되었다.
In order to achieve successful in vitro production of embryo, it is necessary to establish intrauterine environment during in vitro culture. Thus, this study was investigated to establish embryo culture system using co-incubated collagen matrix gel (CM) with endometrial epithelial cells (EC). Endometrial epithelial cells were isolated from porcine endometrium at follicular phase, the cells seeded in insert dish for co-incubation with CM-coated culture dish. Then, culture media treated with/without 2.0 IU/ml hCG or 10 ng/ml IL-1β. After incubation for 24 h, the co-incubated insert dishes were removed from CM-coated culture dish before embryo culture. Embryos at 48 h after in vitro fertilization (IVF) were cultured on the dish for 120 h with porcine zygote medium. We determined PTGS-2 expression in the ECs, VEGF protein in co-incubated CM with EC and observed cleavage rate and blastocyst development of embryos at 168 h after IVF. In result, expression of PTGS-2 was higher at co-incubated EC with hCG and IL-1β groups than EC without hCG and IL-1β. The VEGF protein was detected at co-incubated CM with EC, EC treated with hCG and IL-1β groups higher than CM group. Also, cleavage rate was no significantly difference among all group, however, blastocyst development was significantly higher in co-incubated CM with EC treated with hCG group than un-treated groups (p<0.05). Therefore, we suggest that novel embryo culture system using co-incubated collagen matrix gel with endometrial epithelial cells treated with IL-1β is beneficial and useful for enhancing the production of porcine blastocysts in vitro.
The objective of this study was to examine the effect of eCG and various concentrations (20, 40, and 80 ) of porcine FSH on nuclear maturation and intracellular glutathione (GSH) level of oocytes, and embryonic development after parthenogenetic activation (PA) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) in pigs. Immature pig oocytes were matured in TCM-199 supplemented with porcine follicular fluid, cysteine, pyruvate, EGF, insulin, and hormones (10 IU/ml hCG and 10 IU/ml eCG or FSH) for the first 22 h and then further cultured in hormone-tree medium for an additional 22 h. Nuclear maturation of oocytes () was not influencem foreCG and various concentrations FSH. Embryonic development to the cleavage stage () and mean number of cells in blastocyst ( cells) after PA were not altered but blastocyst formation e-treignificaddlor(p<0.05) improvem forthe supplementation eith 80 FSHr(64%) compared to 47%, io8%, iand 47% in oocytes that were treated with eCG, 20,i and 40 FSH,i numectivelo. In SCNT, fusion () of cell-cytoplast couplets and siosequent embryo cleavage () were not influencem fordifferent gonadotropins but blastocyst formation tended to increase forthe supplementation eith 80 FSHr(25% vs. ). Our nuults demonstrated that oocyte maturation and embryonic development after PA and SCNT e-frinfluencem fortype of gcem fortype of gits concentration. In this study, supplementation of maturation medium eith 80 FSHrimproved preimplantation development of PA and SCNT pig embryos, probably by increasing intracellular GSH concentration of matured oocytes.
Spermatogonial stem cells(SSCs) only are responsible for the generation of progeny and for the transmission of genetic information to the next generation in male. Other in vitro studies have cultured SSCs for proliferation, differentiation, and genetic modification in mouse and rat. Currently, information regarding in vitro culture of porcine Germline Stem Cell(GSC) such as gonocyte or SSC is limited and is in need of further studies. Therefore, in this study, we report development of a successful culture system for gonocytes of neonatal porcine testes. Testis cells were extracted from 10~14-day-old pigs. These cells were harvested using enzymatic digestion, and the harvested cells were purified with combination of percoll, laminin, and gelatin selection techniques. The most effective culture system of porcine gonocytes was established through trial experiments which made a comparison between different feeder cells, medium, serum concentrations, temperatures, and O2 tensions. Taken together, the optimal condition was established using C166 or Mouse Embryonic Fibroblast(MEF) feeder cell, Rat Serum Free Medium(RSFM), 0% serum concentration, 37℃ temperature, and O2 20% tension. Although we discovered the optimal culture condition for proliferation of porcine gonocytes, the gonocyte colonies ceased to expand after one month. These results suggest inadequate acquirement of ingredients essential for long term culture of porcine GSCs. Consequently, further study should be conducted to establish a successful long-term culture system for porcine GSCs by introducing various growth factors or nutrients.
본 연구는 돼지 체외수정란 생산효율을 향상시켜 돼지의 품종개량, 형질전환 돼지생산 등과 멸실위험에 처해 있는 유전자원의 보존을 위한 기술로 활용하기 위해 미성숙 난포란의 적정 체외성숙 시간을 알아보고, 배양액의 종류 및 체외 배양시의 산소 농도에 따른 체외수정란의 생산 효율을 확인한 결과는 다음과 같다. 1. 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간별 제2감수분열중기(M II)까지 성숙된 비율이 체외성숙 38, 40, 42시간째에 각각 61.1%, 42.9%
본 연구는 안정된 돼지 체외 성숙 난자를 얻을 목적으로 배양액의 종류 및 배양액에 EGF, , 호르몬 첨가가 돼지 난포란의 체외 성숙에 미치는 영향을 조사하였다. 난포란을 TCM-199, NCSU-23 및 PZM-3으로 48시간 배양했을 때 체외 성숙율은 각각 및 였다. TCM-199로 48시간 배양했을 때 체외 성숙율은 NCSU-23 및 PZM-3 보다 약간 낮은 체외 발생율을 나타냈다. 난포란을 25 ng/ml의 EGF를 첨가한 TCM-199, NC
본 연구는 체외성숙/체외수정 유래의 돼지 난자를 이용하여 체외발달시 배양액의 종류나 교체에 따른 영향을 구명하고자 수행하였다. mNCSU-23에서 체외성숙시킨 다음 mTBM에서 체외수정시킨 난자를 목적에 따라 두 가지로 나누어 실험한 결과는 다음과 같다. 1. 체외성숙/체외수정란을 NCSU-23에서 배양액 교체없이 7일 동안 배양하거나 CZB에서 4일 배양한 다음 Pig-MEM으로 옮겨서 나머지 3일간 배양한 결과, 난분할율은 배양액간 차이를 보이지 않
본 연구는 mNCSU-23에서 체외성숙시킨 난자를 이용하여 돼지 체외수정시 적절한 배양액과 정자농도를 구명하고자 수행하였다. 정액은 액상정액을 이용하였고 체외수정배양액으로 mTBM과 mTLP-PVA, 정자농도는 운동정자수 5, 1 , 5 sperm/로 체외수정 한 다음 NCSU-23에서 체외발달을 유도한 결과는 다음과 같다. 1. 돼지 체외성숙란을 mTBM 또는 mTLP-PVA에서 운동정자수 1 sperm/로 체외수정시킨 다음 체외발달시킨 결과, 정자침
본 연구는 돼지 태아 섬유아세포유래 공여세포를 미세주입에 의해 주입 후 재 조합한 핵 이식 배에 대한 배양액, 세포주기의 동기화, 배양시간 및 난자의 활성화에 따른 융합율과 체외발생율에 대해 조사하였다. 핵 이식 배를 NCSU-23, TL Hepes 및 TZM-3 배양액으로 1시간 및 8시간 배양하였을 때 배반포로의 분할율은 각각 15.6%, 14.0%, 15.0% 및 13.9%, 10.5%, 13.3%로서 배양액 및 시간에 따른 분할율의 유의적인 차이