체외 환경에서 생산되는 배아 (Embryo)는 활성산소종 (Reaction oxygen species, ROS) 수준이 일정 수준을 초과함에 따라 산화적인 손상을 받게 된다. 선행연구에 따르면, 항산화제는 ROS를 감소시켜주는 효과를 가지기 때문에 ROS로부터 오는 배아의 단백질, DNA의 손상, 세포 자멸사를 방지하여 배아의 발달률을 향상시킨다. 이전연구에 따르면 항산화제로써 엘라그산 (Ellagic acid, EA)은 ROS를 효과적으로 제거하고, 난자의 산화스트레스를 방지하는 효과를 가지고 있다고 보고되었다. 그리하여, 본 연구를 통해 우리는 소의 수정란 배양체계 중 in vitro culture (IVC) 단계에서 EA의 농도 (0, 5, 10 μM) 별 첨가가 소의 수정란 발달률과, 질적 수준에 미치는 영향을 조사하고자 실험을 진행하였다. 결과적으로, 배반포의 단계별 발달 수준에서 cleavage 형성률은 EA첨가군과 대조군 간의 차이를 발견할 수 없었으나 배반포 형성률에서는 모든 EA 첨가군들이 대조군보다 높았고 EA 첨가군 중에 5 μM 첨가군이 가장 높았다 (p < 0.05). 생산된 배반포의 총 세포 수는 5 μM EA 첨가군이 대조군과 10 μM EA 첨가군 보다 유의적으로 높았으며, 대조군과 10 μM EA 첨가군 사이의 유의적 차이는 없었다 (Control vs. 5 μM vs. 10 μM; 137 ± 7.90 vs. 163.2 ± 7.42 vs. 138.8 ± 6.67, p < 0.05). 세포 자멸사 세포 수는 모든 EA 첨가군들이 대조군보다 유의적으로 낮았다 (Control vs. 5 μM vs. 10 μM; 22.65 ± 4.08, 9.61 ± 1.55, 6.14 ± 0.90, p < 0.05). ROS 수준에서 모든 EA 첨가군들과 대조군 간의 유의적 차이는 없었다 (Control vs. 5 μM vs. 10 μM; 6.81 ± 1.31, 3.86 ± 0.23, 4.11 ± 0.18, p < 0.05). qRT-PCR 실험 결과에서 Nrf2 gene expression은 대조군과, 5 μM 첨가군에서 유의적 차이가 없었으나, 10 μM 첨가군에서는 유의적으로 상향 조절된 것을 관찰하였다. Keap1 gene expression은 5 μM 첨가군에서 유의적으로 하향 조절된 것을 관찰하였다. 하지만 EA의 농도가 10 μM으로 높아짐에 따라 발현 수준이 증가한 것을 관찰할 수 있었다. CAT gene expression은 5 μM 첨가군에서 유의적으로 상향조절 되었으나 10 μM 첨가군에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. SOD1 gene expression은 대조군과 5 μM 첨가군은 유의적인 차이를 보이지 않았으나 10 μM 첨가군에서는 유의적으로 상향 조절된 것을 관찰하였다.

To increase the productivity of in vitro development, the antioxidants have been used for culture system of bovine oocytes and embryos. However, comparative studies on these molecules are rare and direct beneficial effects on blastocyst production cannot be discriminated for best results. The study was conducted to determine the influence of N-acetyl-L-cysteine (NAC), N-acetyl-L-cysteine amide (NACA), glutathione (GSH) and cysteamime (CYS) on maturation competence of COCs from GV to MII stage and productivity of blastocyst formation during in vitro fertilization and culture. There was no difference among maturation rates of oocytes to metaphase II with polar body with antioxidants for any of the treatment groups (p>0.05). However, the significant improvement on the rate of blastocysts (32.3±5.0%) was found in 0.1 mM CYS treatment than 0.3 mM NAC, 0.2 mM NACA or 0.5mM GSH (p<0.05). The addition of NAC (18.8±3.7%) or NACA (21.2±3.9%) did not improve development competence to morula and blastocysts than control (24.4±4.1%) and GSH (26.5±5.0%) (p>0.05). Our study showed that medium supplementation with CYS during IVM and IVC improved the rate of bovine embryo development but not with NAC, NACA and GSH addition.

MMP-2, 9의 경우 난포의 발달, 난자의 성장, 그리고 배란 시 extracellular matrix를 재 구성하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 혈청배지 및 무혈청배지를 이용한 체외수정란의 배아발달 과정에 따른 MMPs(2, 9)와 TIMPs(2, 3)의 발현양상의 차이가 있 을 것으로 사료된다. 따라서 본 연구는 소의 체외성숙난자와 체외수정방법에 따른 체외수정란의 발달율과 cumulus cell(CC), single oocyte cell(SOC), cumulus oocyte complex(COC) 및 blastocyst 에서 MMPs와 TIMPs의 활성 및 단백질발현양상을 zymography와 ELISA에 의하여 분석 하였으며, immunofluorescence를 이용하여 발현위치분석을 실시하였다. 체외성숙 이후 Real-time PCR을 이용하여 mRNA의 발현양상을 분석한 결과 MMP-2, 9은 CC가 SOC보 다 높은 발현을 보였으며, TIMP-2, 3의 경우 상반된 발현양상을 보이고 있었다. MMPs의 활성도 분석결과도 mRNA의 결과와 같았으며, 배양배지의 MMPs의 단백질양적분석에서 도 같은 양상을 나타내고 있었으나, TIMP-2의 경우 SOC가 높은 발현을 보였으며, TIMP-3는 CC에서 높은 발현을 나타냈다. 위의 결과를 토대로 COC의 MMPs와 TIMPs의 단백질 작용위치를 분석한 결과 MMP-2는 난자의 세포질을 중심으로 발현양상을 나타내 고 있었으며, MMP-9에 비하여 높은 발현을 확인할 수 있었다. TIMPs의 경우 난자의 세 포질보다 난구세포에서의 발현이 높게 나타났으며, TIMP-3의 발현이 높게 나타났다. 체 외배양방법에 따른 blastocyst의 발달율은 무혈청배지(ES)(61.22% 60/98)가 혈청배지(CR- 1aa)(48.28% 28/58)보다 높은 발달율을 보였다. 체외수정배양배지의 MMPs의 단백질양적 분석결과 MMP-2는 ES가 CR-1aa보다 상대적으로 높은 발현을 보였고, MMP-9은 CR- 1aa가 ES보다 높은 발현을 보였다. TIMPs의 발현양상의 경우 대체적으로 TIMP-3의 발 현이 높게 나타났으며, apoptosis의 활성도 분석에서 Casp-3의 발현이 CR-1aa배양에서 높게 나타남을 확인할 수 있었다. MMPs와 TIMPs의 단백질작용위치를 분석한 결과는 ES는 MMPs와 TIMPs의 발현이 inner cell mass를 중심으로 발현이 높게 나타났으며, trophoblast에서는 낮은 발현이 나타났다. 이와 반대로 CR-1aa의 경우 ES와 다른 위치의 발현을 나타냈으며, TIMPs의 발현은 대체적으로 낮게 발현되었다. 따라서 본 연구 결과 는 무혈청배양 방법이 수정란의 발달 시 MMPs의 활성을 높여 배아형성에 영향을 줄 수 있을 것이라 사료된다.

본 연구는 소 체외 수정란의 팽창 및 hatching시 prostaglandin 와 prostaglandin 의 영향에 대하여 검토하였다. 체외 수정란의 체외 배양시 다음과 같이 (1) 0, 1, 10 및 100ng/ml , (2) 0, 1, 10 및 100ng/ml , (3) low (1ng/ml : 1ng/ml), (4) low , (5) high (10ng/ml : 1ng/ml), (6) high : high (10ng/ml : 10ng/ml)로

본 연구는 소 체외수정란과 체세포 복제란의 초자화 동결 및 융해 후 생존능을 검토하였다. 배반포로 발육된 체외수정란 및 체세포 복제란을 초자화 동결법에 의해 동결하였다가 융해하여 생존율 및 배양 후 부화율을 검사하였다. 체외수정란 배반포를 초자화 동결 융해한 결과, 확장배반포가 배반포기 난자에 비하여 생존율(82.1%, 96/117)과 부화율(64.1%, 75/117)에서 모두 유의적으로 높았다(p<0.05). 핵이식 배반포 복제란을 초자화 동결 융해한 경우도 체외수정란과 비슷한 경향을 보여 확장 및 부화배의 생존율과 부화율이 각각 81.1%(30/37)와 78.3%(29/37)로, 배반포(각각 71.8 및 53.8%)에 비하여 다소 높게 나타났다. 본 연구의 결과는 초자화 동결 방법에 의해서 소 체외수정란과 체세포 복제란을 성공적으로 동결할 수 있으며, 특히 후기 배반포기 단계에서 초자화 동결 시 높은 생존율과 부화배 형성율을 얻을 수 있음을 보여준다.

본 연구는 도축되는 소 난소의 효율적인 이용을 위해서 도축장으로부터 실험실로 운반되는 난소 수송 온도에 따른 체외 수정란 생산 효율을 조사하고자 실시되었다. 도축장의 HACCP 적용으로 도축장 출입이 불가능하므로 위탁하여 난소를 공급받게 되어 취급자의 부주의로 적절한 온도 유지가 되지 않는 경우가 많다. 특히 겨울철에는 더 많은 주의가 필요하다. 따라서 본 실험에서는 겨울철 난소수송 온도에 따라서 4처리 그룹, 즉 (T1), (T2), (T3) 그리고

수정란의 성 판별은 유전적으로 우수한 유전형질을 보유하고 있는 소의 수정란을 성 판별하므로서 희망하는 성의 송아지를 생산할 수 있으며, 부가가치가 높은 수정란을 확보할 수 있는 기술이다. 수정란의 손상을 최소화하면서 할구를 biopsy하는 기술을 개발하고, 간단하고 빠른 시간에 성 판별이 가능한 Loop-mediated isothermal amplification방법으로 수정란을 성 판별을 실시한 결과는 다음과 같다. 1. 한우 체내 수정란의 성비는 암

체외수정 후 체외배양48시간에 난구세포의 제거 유ㆍ무에 따라 CR/sub 1aa/ 배양액에 homoglobin을 0, 1, 5 ㎍/㎖를 첨가한 구의 상실배기 이상 체외발육성 적은 난구세포를 제거한 구에서 23.8%, 33.3% 및 26.8% 였으며, 난구세포를 제거하지 않은 구에서는 각각 39.5%, 54.8% 및 48.8%로서 난구세포를 제거하지 않은 구에 Hb를 1 ㎍/㎖를 첨가한 구가 여타구보다 통계적으로 높은 결과를 얻었다(P<0.05). 체외수정 후 체외배양 96시간 후 난구세포를 제거 유ㆍ무에 따라 Hb를 0, 1, 5 ㎍/㎖를 첨가하였을 때, 상실배기 이상 체외발육성적은 난구세포를 제거한 구에서 각각 28.6%, 46.2% 및 39.1%였으며, 난구세포를 제거하지 않은 구에서는 각각 33.9%, 67.2% 및 46.0%로서, 난구세포를 제거하지 않은 구에 Hb를 1 ㎍/㎖를 첨가구가 여타구에 비해 통계적으로 유의하게 높게 나타났다(P<0.05). CR/sub 1aa/ 배양액에 L-NAME를 0, 10, 50 및 100 mM을 첨가한 구에서 상실배 이상 발육된 체외발육성적은 각각 55.6%, 64.9%, 58.8% 및 66.7%로써 L-NAME 첨가구가 무첨가구에 비해 커다란 차이가 나타나지 않았다(P>0.05). 모든 처리구에 배반포까지 발육된 체외수정란의 세포수에는 커다란 차이가 인정되지 않았다.

발생학에서 키메라(chimera)는 2개 이상의 다른 유전자형의 세포, 또는 다른 종의 세포로부터 만들어진 1개의 생물개체를 뜻하는 말로, 이는 초기 수정란의 발달과 포유류의 분화를 연구하는데 이용되고 있다. 키메라를 만드는 방법에는 할구와 내세포괴를 응집시키는 방법과 배반포 내에 여러 종류의 세포를 주입하는 방법이 있다 본 실험에서는 서로 다른 두 가지 방법의 활성화 처리법, 즉, ionomycin 처리 후 Cycloheximide (CHX) 또는 6

This study was conducted to establish the optimal culture conditions for in vitro production of bovine embryos derived from slaughter house ovaries. Cumulus-oocyte- complexes (COCs) collected by aspiration from follicles of 2~7 mm in diameter were matured in Ham's F-10 medium supplemented with 0.01 /m1 epidermal growth factor (EGF) at 39 in a humidified atmosphere of 5% in air. After 24 hrs of culture, the oocytes were co-cultured with epididymal sperm selected off by Percoll-density gradient in TALP medium for 24 hrs. The presumptive zygotes were cultured in HECM-6 medium for 3 d post-insemination, and followed by cultured in TCM199 medium until 7 to 10d post-insemination. The cultures were compared of their cleavage and development into later stage in culture medium by additions of different protein sources (PVA, BSA and BCS) and by different embryo density. The rates of cleavage and development rates into blastocyst were not significantly (P<0.05) different among the culture media containing with BSA (75.0% and 40.5%), BCS (76.7% and 38.0%) and PVA (72.5% and 42.2%), respectively. Significantly (P<0.05) higher blastocysts rates were obtained in culturing of 30 and 40 embryos in each 50l droplets of culture medium than in 5, 10 and 20 embryos. These results indicate that the optimal density of embryos is 30~40 embryos in a 50l droplet of culture medium. Furthermore there is no effect of different protein sources on early embryonic development.

the present study was carried out to develop a completely defined culture system and determine if high NaCl concentrations in defined (PVA added) or semi-defined (BSA added) medium is toxic to bovine embryos. Oocytes from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro. After 30 h of insemination, only 2-cell stage embryos were selected and cultured for this experiment. The culture media used were as follows : TLP(114 mM of NaCl) + BSA (3 mg/ml), TLP + PVA (1 mg/ml), mTLP(96 mM of NaCl) + BSA, mTLP + PVA. Six to ten embryos were placed into a 301 drop of each medium and the embryos were examined at 10 day post-insemination without medium renewal. The experiment was replicated 4 times. All data were analyzed by chi-square. There were no significant differences among TLP-BSA, mTLP-BSA and mTLP-PVA in blastocyst development (21.6, 17.2 and 20.2%), respectively. Also, no differences were obtained in hatching rates (11.7, 9.9 and 12.2%), respecitively. However, there were significant differences between TLP-PVA (1.7% and 0.6%) and other group in blastocyst formation and hatching rates, respectively (p<0.01). Development of in vitro produced embryos cultured in BSA containing medium was not affected by high NaCl concentration, but in the completely defined medium, embryonic development was highly affected by NaCl. This study shows that reduced NaCl concentration in completely defined medium is beneficial for development of bovine pre-implantation embryos in vitro.