본 연구에서 생쥐 초기 배아를 이용하여 동결 보존된 배아의 생존율 또는 발달율에 영향을 미치는 요인들의 상관관계를 알아본 결과, 배아의 발달 단계에 따른 동결 - 해동 후 생존율에 있어서는 2세포기 배아가 4~8세포기 배아보다 유의하게 높았으나(p＜0.01), 배 발달율에 있어서는 4~8세포기 배아가 유의하게(p＜0.01), 높아 생존율과 배 발달율과는 상관관계가 없는 것으로 사료된다. 또한, 동결 보호제에 따른 배아의 생존율에 있어서는 2, 4~8세포기 배아 모두 DMSO에서 유의하게 높았으나(p＜0.01), 배 발달율에 있어서는 EG가 DMSO에 비해 더 유의하게 높은 성적을 나타내어(p＜0.01, p＜0.05) 동해로 인한 상해가 적은 것으로 생각되어 2, 4~8세포기 배아에서 EG가 더 효과적인 동결 보호제로 사료되며, 동결 프로그램으로는 완만 동결 - 급속 해동법이 더 우수한 프로그램으로 보인다.

생쥐 2세포기, 4세포기, 8세포기를 각 발생 단계에서 채취하여 동결 보호제를 첨가한 서로 다른 배양액에서 배양하고, 배아의 동결 보존 및 융해 시 급속 처리와 저속 처리 단계로 비교하여 이들 조건이 배아의 생존과 발현에 미치는 영향을 조사하여 다음의 결과를 얻었다. 동결 보호제로 처리하여 배양액을 달리한 경우, 급속 단계에서는 모든 배양액에서 비슷한 발생율을 보였고, 저속단계의 4세포기와 8세포기는 D-PBS에서 높은 발생율을 보였다(P＜0.05, P＜0.01). 배아의 발생 시기에 따른 동결 보존 후, 발생율은 2, 4, 8세포기로 넘어갈수록 발생율의 증가를 보여 8세포기에서 발생율이 가장 높았다(P＜0.01). 동결 보호제의 처리단계에 따른 발생율은 2세포기의 급속 단계에서는 유사하였으나, 4세포기와 8세포기는 저속단계에서 높은 발생율을 보였으며(P＜0.05), 특히 8세포기에서 가장 높았다(P＜0.01).

본 연구는 시험생물로서 말똥성게 (Hemicentrotus pulcherrimus) 를 이용하여 내분비계장애물질인 bisphenol A (BPA)의 독성 및 시험생물로서의 적합성 등을 조사하였 다. 말똥성게(H. pulcherrimus)의 수정 및 정상 배아발생 에 미치는 BPA의 독성을 보기 위하여 농도(0, 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb)에서 조사하였다. BPA 노출 시 수정 률은 시험구간 내의 BPA 처리농도와 관계없이 유의적인 변화가 없었다. 정상 배아발생률은 BPA 농도가 높을수 록 유의적인 감소를 나타냈으며, 800 ppb 농도부터 유의 적인 감소를 보였다. 정상배아발생에 대한 독성값은 반 수영향농도 (EC50) 1056.1 ppb, 95% Cl 981.8~1163.9 ppb 로 나타났다. 또한 무영향농도 (NOEC)와 최소영향농도 (LOEC)는 500 ppb 및 800 ppb로 나타났다. BPA에 노출 된 배아는 농도가 증가함에 따라 발생이 정체되는 현상 이 나타났다. BPA에 노출된 pluteus 유생을 이용한 glutathione- S-transferase (GST) 유전자의 발현을 비교해본 결과 GST 유전자의 발현은 농도가 증가함에 따라 발현 이 증가하였다. 본 연구 결과, 말똥성게 (H. pulcherrimus)의 초기 배아 발생 과정 중 800 ppb 이상에서 독성을 나타냈으며 GST 유전자는 BPA 노출에 따른 위해성 평가에 생체지표유 전자로 유용하게 이용될 수 있다고 생각된다.

The aim of the present study was to investigate the cleavage pattern, its developmental ability and apoptosis of porcine embryo in vitro. Morphology data on a total of 919 embryos were analyzed retrospectively. Forty-eight hours after insemination, embryos were classified into five groups based on the cleavage state as follows; 1 cell, 2 cell, 4 cell, 5 to 8 cell and fragmentation. These groups were cultured another 120 hours and then evaluated for blastocyst formation. Blastocyst formation rates were significantly higher in 4 cell (42.5%) and 5 to 8 cell (48.6%) cleaving groups than in other groups (p<0.05). On the other hand, 2 cell and fragmentation groups produced 4.9% and 3,9% blastocysts, respectively. And we could verify that in the event of 2 cell block and fragmentation of embryo. To analyze the apoptotic frequency in preimplantation development of porcine IVF embryos, all cells of each blastocyst were performed by TUNEL assay. There were no significantly differences in the total cell numbers of embryos and apoptotic cell rate in blastocysts among the each classified groups. Data suggest that 4 cell and 5 to 8 cell cleaving embryos at 48 hour after insemination have high developmental competence, and may be an useful parameter to predict the development of preimplantation embryos and to study using preimplanation embryonic research.

In order to obtain novel genes related to the human craniofacial development, molecular cloning and sequencing, and in situ hybridization using craniofacial tissue sections were performed and followed by protein structure simulation. Totally 231 clones were obtained from the subtracted craniofacial tissue cDNA library of human embryo. Random cloning using the non-redundant clones from the craniofacial tissue of human embryo was done and obtained 398 clones from the premade human chondrocyte cDNA library. Their partial sequence data showed that 214 clones of subtracted cDNA library of craniofacial tissue were still non-redundant in Genebank search. And 20 clones among 498 clones of premade chondrocyte cDNA library were known to be undefined genes. Through in situ hybridization screening in the craniofacial tissue sections of 10 weeks old human embryo 36 clones were found to be positive in specific tissues. Depending on the cell types of sirnilar developmental origin, the positive reactions could be divided into five groups. Among the 20 clones of undefined genes from human chondrocyte cDNA library, 7 clones showed characteristic positive reaction in human cartilage tissue by in situ hybridization. From the simulated protein structure, motif analysis and in situ hybridization studies for the 7 undefined clones, Ch89, Ch96, Ch129, Ch285 clones may function in the outer space of the cell constituting a part of matrix protein complex, and Ch276 as a transmembrane protein which might partic ipate in matrix calcification around chondrocytes. Ch153 is a kind of antirnicrobial protein also acting as an inflammation mediator, and Ch334 clone is a zinc finger protein, of which expression increases in human adult tissues We presume these novel genes from human chondrocytes may provide a new path of chondrocyte development and functions of human craniofacial tissues

미토콘드리아는 세포내의 에너지대사에서 중요한 역할을 수행하는 세포내 소기관이며, 자체의 유전물질이 모계를 통해 유전되는 특징을 가지고 있다. 포유류 초기 배아의 발생과정에서 미토콘드리아의 역할과 기능에 대한 연구는 미진한 상태이다. 본 연구에서는 생쥐 초기 배아의 발생과정에서 관찰할 수 있는 미토콘드리아 미세구조의 변화 양상을 살펴보고, 이와 초기 배아의 발생 능력과의 관련성을 밝혀보고자 하였다. 과배란 유도된 ICR 생쥐로부터 배란된 난자와 2-세포기 배아를 수획하여 76 배양액으로 포배기까지 체외배양하면서, 각각의 발생단계에 따라 시료를 수획하였다. 미토콘드리아 미세구조의 변화는 일반적인 투과전자현미경방법(TEM)을 이용하여 관찰하였다. 미토콘드리아의 미세구조는 배란 난자에서 4-세포기 배아까지는 구형이고 크리스타가 발달하지 않은 원시형태였지만, 포배기로 발달함에 따라 크리스타가 발달된 막대형의 전형적인 미토콘드리아로 분화됨이 관찰되었다. 체외배양 중에 발생이 지연되거나 정지된 배아에서 관찰한 미토콘드리아의 미세구조는 공포화 (vacuolization), 크리스타 발달 지연, 손상된 미토콘드리아의 세포막 등과 같은 비정상적인 변형을 관찰할 수 있었다. 또한, 극체에 존재하는 미토콘드리아의 미세구조는 정상적인 핵내의 유전자와의 상호작용이 없어 미분화 상태로 포배기까지 유지되는 것을 관찰하였다. 이상의 결과를 통해 미토콘드리아의 정상적인 분화 과정이 초기 배아의 발생능력과 관련되어 있음을 알 수 있었으며, 포유류 초기 배아의 체외배양시스템을 개선하는데 미토콘드리아 미세구조의 관찰과 변화에 대한 고려가 있어야 될 것으로 생각된다. buffer A 용액으로 세척하여 유리 petri dish의 바닥에 부착된 macrophage만을 cell scraper로 분리하였다. 분리한 macrophage는 0.5-1 cells/가 되게 조정하여, IL-I 을 0.001, 0.01, 0.1 또한 1 ng/를 첨가하여 농도에 따른 효과를 조사하였고, 각각 24, 48, 72, 96 또한 120시간을 배양하여 시간에 의한 효과도 실시하였다. 각 배치구에서 얻어진 배양액은 TGF-를 조사하기 전까지 -2에 동결 보존하였다. TGF-의 측정은 TGF- kit(promega, USA)를 이용하여 실시하였으며, 통계학적 분석은 Anova test를 Statview program을 이용하여 분석하였다. 시험의 결과 대조구에 비해 IL-I 첨가구는 2-3배의 TGF-생산을 보였으며, 배양시간에 따른 생산은 시간이 지남에 따라 약간 상승하는 경향을 보였으나, 유의적인 차이를 보이지는 않았다. 또한 IL-I의 농도에 따른 생산의 변화는 IL-I의 농도에 따라 약간의 차이를 보였고 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 임신 및 비임신의 경우 임신우의 비장 macrophage가 비임신보다는 약간 상승하는 거스로 나타났다. 이상의 결과로 볼 때 IL-I 는

염색체의 구조적 이상으로 인한 습관성 유산과 기형아의 출산을 예방하기 위해 착상전 배아에서 할구를 분석하여 정상적인 핵형을 가진 배아만을 이식하는 착상전 유전자 진단 (preimplantation genetic diagnosis, PGD)의 성공적인 임상 적용이 보고되고 있으며, 그 적용 범위가 확대되고 있다. 그러나 일반적인 간기의 핵상을 이용한 PGD에서는 형광직접보합법 probe의 제약으로 보인자와 정상적인 핵형을 구분할 수 없는 단점이 있다. 따라서 본 연구에서는 보다 정확한 PGD를 위해 생쥐 배아를 이용하여 분리한 할구에서 중기 염색체상을 획득하기 위해 미세소관 (microtubule) 형성 저해제를 처리하였으며, 이를 통해 확립된 방법을 인간의 PGD에 적용하고자 하였다. 과배란이 유도된 ICR 생쥐에서 4- 또는 8-세포기 배아를 수획하여 colcemid, nocodazole, vinblastine을 각각 0.1, 0.5, 1.0, 5.0M을 처리하고, hoechst 33342로 염색하여 핵상을 관찰하여 최적의 농도를 결정하였다. 또한 각 미세소관 형성 저해제를 혼합 처리하여 가장 높은 중기 염색체상을 획득할 수 있는 혼합 처리를 결정하였다. 이렇게 결정된 혼합 처리 방법을 인간의 체외 수정 및 배아 이식술에서 획득된 3PN 배아에 처리하여 중기 염색체를 획득하였다. Colcemid, nocodazole, vinblastine 모두 1 M이 최적 농도임을 확인할 수 있었다 (각각 96.3%, 92.0%, 98,4%). 미세소관 형성저해제를 혼합 처리하였을 경우 nocodazole과 vinblastine (각각 1M)을 혼합 처리했을 때 중기 염색체 획득률(97.3%)이 가장 높았다. 인간의 3PN 배아에 1M의 nocodazole과 vinblastine을 혼합 처리한 후, 113개의 할구를 분석하여 44개(38.9%)의 할구에서 중기 염색체를 확인할 수 있었다. 본 실험 결과를 통해 중기 염색체를 획득하기 위하여 미세소관 형성 저해제를 처리하는 방법은 생쥐의 배아에서는 효과적이지만, 인간의 배아에서는 그 효율이 다소 낮음을 알 수 있었다. 그러나 이 방법을 개선하여 인간의 할구에서 중기 염색체의 획득률을 높이고, 이를 염색체의 구조적 이상에 대한 착상전 유전자 진단에 적용한다면, 보인자와 정상의 핵상을 구분하여 정상의 핵상만을 갖는 배아의 이식을 통하여 더욱 정확한 착상전 유전자 진단을 시행할 수 있으리라 사료된다.

Copper Chloride (CuCl2)는 수계생물에 매우 강한 독소로 작용한다. 이에 한국 토착 양서류인 무당개구리(Bombina orientalis)의 배아를 이용하여 CuCl2의 독성에 대하여 알아보고자 하였다. 배아 발생 독성 실험, Trypan blue 염색, 동물극 분리체의 예정 중배엽 유도, MTT 분석, real-time PCR을 수행하였다. 결과로, 생존율에 근거한 반수치사농도는 6.50 μM, 기형율에 근거한 반수기형농도는 2.13 μM로 확인되었다. 주요 기형패턴으로는 head malformation, bent tail이 관찰되었고, 3 μM 이상의 농도에서 두부와 미부의 유의적인 성장 저해가 관찰되었다. 10 μM 이상의 농도에서 배아 전체의 세포사멸이 이루어짐을 확인하였다. 동물극 분리체의 길이신장과 길이/폭 비율이 1 μM 이상의 처리군에서 유의적인 감소를 보였다. MTT 분석 결과, 10 μM 이상의 농도에서 유의적인 감소를 보였다. 중배엽 관련 유전자 중 goosecoid, noggin, chordin, follistatin가 1 μM 이상의 처리군에서 유의적인 감소를, epidermal keratin가 10 μM 이상의 농도에서 유의적인 증가를 보였다. Apoptosis 관련 유전자 중 BAK와 BAX는 각각 10 μM 이상의 농도에서 유의적인 감소와 증가를 보였다. 이 연구를 통하여, CuCl2가 무당개구리 배아의 중배엽 관련 유전자의 발현을 저해함으로서, 발생 과정의 장애를 유발하는 것으로 사료된다.

산업화에 의해 생성된 여러 가지 오염물질 가운데 중금속인 니켈 (Ni)과 코발트 (CoⅡ)는 연안해역으로 유입 시 극히 미량일지라도 생체 내 축적되어 해양생물의 생리 및 발생에 장애를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 먹이연쇄 (food chain)를 통해 생물확대 (biomagnification)됨으로써 해양생태계 전반에 영향을 미칠 수 있다. 성게는 중요한 수산생물로서 발생학 연구가 시작된 이래 해양생물 발생연구의 모델이 되어왔다. Metallothionein은 세포내 유해중금속을 제거하는 기능을 가진 금속결합단백질이며, TGF-β의 activin subfamily로 알려진 Nodal은 척추동물에서 중배엽 및 축 형성에 관여한다고 알려져 있다. 본 연구는 조간대 암반 지역에 서식하는 말똥성게 (Hemicentrotus pulcherrimus)를 이용하여 Ni과 CoⅡ가 말똥성게 (H. pulcherrimus)의 수정 및 배아 발생에 미치는 영향에 대하여 관찰하였다. 말똥성게 (H. pulcherrimus) 체강에 0.5 M KCl를 주입하여 방란 및 방정을 유도하였다. 수집한 정자는 Ni 농도 (0, 10, 25, 50, 100, 500 ppb) 및 CoⅡ 농도 (0, 10, 100, 500, 1,000, 2,500 ppb)에서 30분간 노출시킨 후, 난자와 수정을 시켰다. 수정 10분 후 수정막의 형성 여부를 관찰하여 수정률을 조사하였다. 정상적인 배아발생률은 정자와 난자를 인공수정시킨 후, 각각의 Ni 및 CoⅡ 농도에서 64시간 배양한 후, 플루테우스 유생 (pluteus larva)을 정상과 비정상으로 구분 관찰하여 정상적인 배아발생률을 조사하였다. Ni 노출 64시간째 플루테우스 유생을 대상으로 metallothionein 및 nodal mRNA 유전자 발현을 각각의 유전자 프라이머를 이용하여 annealing온도 50℃에서 중합효소연쇄반응법으로 관찰하였다. 연구결과 수정률은 Ni 및 CoⅡ 농도에 유의적인 영향을 받지 않았다. 정상적인 배아발생률은 Ni 및 CoⅡ 농도가 높을수록 농도 의존적으로 정상적으로 발생하는 개체가 유의적으로 감소하였다. Metallothionein mRNA 유전자는 Ni 농도 10 ppb에서부터 대조군에 비하여 발현이 높게 나타났다. Nodal mRNA 유전자는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 말똥성게 (H. pulcherrimus) 배아 발생에 미치는 Ni 및 CoⅡ의 영향을 독성치로 나타낼 때, 무영향농도 (NOEC)는 ＜10 ppb로 같게 나왔으며, 최소영향농도 (LOEC)는 각각 25, 10 ppb를 나타냈으며, 반수영향농도 (EC50)는 각각 34.19 및 71.84 ppb를 나타내었다. 본 연구 결과, 말똥성게 (H. pulcherrimus)의 배아발생률을 이용한 생태독성평가 시 Ni＞ CoⅡ순으로 독성이 강한 것으로 나타났으며, 이들 중금속이 연안 해역에 유입되어 10 ppb를 초과할 경우, 연안 생태계 내에 서식하는 생물의 재생산에 유해한 영향을 미칠 것으로 사료된다.

페놀류는 석유정제, 섬유산업, 도로포장 및 광산산업 등의 폐수에 다량 함유되어 있는 내분비계장애 및 독성 물질로서 연안해역으로 유입 시 해양 서식 생물의 생식세포 및 배아 발생 등에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. Metallothionein은 금속결합단백질로서 세포내 중금속이 존재할 경우 결합하여 유해중금속을 제거하는 기능을 하며, Nodal은 척추동물에서 TGF-β의 activin subfamily로 중배엽 및 축 형성에 관여한다고 알려져 있다. 성게는 수정 및 배아 발생과 같은 초기생활사 연구에 중요한 생물 종으로서 유해물질 위해 평가에 유용하게 이용되고 있다. 본 연구는 우리나라 조간대 암반 지역에 서식하는 말똥성게 (Hemicentrotus pulcherrimus)를 이용하여 페놀 (phenol)이 말똥성게 (H. pulcherrimus)의 수정 및 배아 발생에 미치는 영향에 대하여 관찰하였다. 성숙한 말똥성게 (H. pulcherrimus) 체강에 0.5 M KCl를 주입하여 방란 및 방정을 유도하였다. 수집한 정자는 phenol 농도 (0, 10, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000 ppb)에서 30분간 노출시킨 후, 정상 난자와 인공수정을 시켰다. 수정 10분 후 수정막의 형성 여부를 관찰하여 수정률을 조사하였다. 정상적인 배아발생률은 정자와 난자를 인공수정시킨 후, phenol 농도 (0, 10, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000 ppb)에서 64시간 배양한 후, 플루테우스 유생 (pluteus larva)을 정상과 비정상으로 구분 관찰하여 정상적인 배아발생률을 조사하였다. Metallothionein 및 nodal mRNA 유전자 발현은 phenol 노출 64시간째 플루테우스 유생에서 total RNA를 추출한 후, oligo (dT)와 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA는 metallothionein과 nodal mRNA 유전자 프라이머를 이용하여 annealing온도 50℃에서 중합효소연쇄반응 (PCR) 방법으로 발현을 관찰하였다. 연구 결과, 수정률은 phenol 농도에 유의적인 영향을 받지 않았다. 정상적인 배아발생률은 phenol 농도가 높을수록 정상적으로 발생하는 개체가 감소하는 농도 의존성을 나타냈다. Metallothionein mRNA 유전자는 phenol 농도가 증가할수록 발현이 높게 나타났으나, nodal mRNA 유전자는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 말똥성게 (H. pulcherrimus) 배아 발생에 미치는 phenol의 영향을 독성치로 나타낼 때, 무영향농도 (NOEC)는 ＜10 ppb, 최소영향농도 (LOEC)는 100 ppb를 나타냈으며, 반수영향농도 (EC50)는 1,565.86 ppb를 나타내었다. 본 연구 결과, 연안 해역에 유입되는 phenol이 무영향농도 (NOEC) 10 ppb를 초과할 경우, 성게를 비롯한 조간대 암반에 서식하는 생물종의 생식 및 발생에 유해한 영향을 미칠 것으로 판단된다.

수정란이 포배로 분화하는 것은 착상을 통하여 개체 발생이 성립되는 포유동물의 발생에 있어서 핵심적인 현상이다.. 초기 배아 발생 시기동안 배아는 생존을 위한 에너지원을 공급받아야 한다. 포유동물의 난자는 보통의 경우 난자 형성 동안 많은 양의 에니지원을 세포질에 비축하지 않기 때문에 발생 동안 수란관과 자궁으로부터 물질대사와 관련돼 여러 물질, 특히 에너지원을 획득해야 한다. 탄수화물은 착상전 배아의 주 에너지원으로 알려져 있다. 포도당, 젖산염, 피르

세포내 칼슘은 다양한 세포에서 중요한 생리적 반응을 일으키며, ruthenium red와 ryanodine은 중요한 칼슘 조절자로 작용한다. Ruthenium red는 세포내 칼슘 저장고에서의 calcium induced calcium release(CICR)를 저해한다. Ryanodine은 ryanodine 통로를 통한 칼슘 방출을 촉진한다. 본 실험은 두 조절자가 생쥐 난자와 초기배아의 세포내 칼슘이온 농도에 영향을 미치는지 여부와 그 유효농도를 알

Aquaporin은 막관통 통로 단백질(transmembrane channel protein)로서, 삼투압의 농도구배에 따라 세포막을 가로질러 물분자를 이동시키는 기능을 하고 있다. 포유류 초기배아에서 포배강 형성은 영양외배엽세포에서 ATPase에 의한 이온 농도 구배가 형성되면 auqaporin에 의해 물이 포배강으로 유입되면서 이루어진다. 본 연구에서는 생쥐 초기배아에서 반정량적인 역전사 중합효소 연쇄반응 방법(semi-quantitative RT-

Insulin과 tumor necrosis factor alpha(TNF-)에 의한 초기 배아 발생의 조절기작을 알아보고자 생쥐의 상실배를 대상으로 이들이 첨가된 배양액에서 형태발생, 세포증식을 조사하고, 포배에서 mitogen activated protein kinase(MAPK, ERK1/2)의 활성 변화에 미치는 영향을 조사하였다. Insulin은 상실배의 체외발생 및 포배내 할구 수를 대조군에 비해 유의하게 증가시켰으며, TNF-는 발생율을 유의