본 연구는 제주도 모슬포 해역에서 채집된 대형 포식성 복족류인 붉은입두꺼비고둥(Tutufa bufo) 두 개체를 대상 으로 테트로도톡신(TTX) 존재 여부를 조사하였다. 일본에 서 채집된 붉은입두꺼비고둥의 내장에서 TTX가 검출된 사례가 보고된 바 있으며, 최근 제주도 남부 해역에서 해 당 종이 혼획되고 있으나, 한국 해역에 분포하는 붉은입 두꺼비고둥의 TTX 축적에 대한 정보는 부족하다. 이에 본 연구에서는 경쟁적 효소면역분석법(cELISA) 을 사용하여 붉은입두꺼비고둥의 주요 연조직(전타액선, 구강부, 소화 선, 생식소, 아가미, 신장, 근육, 후타액선)을 분석하였다. 분석 결과, 모든 조직에서 TTX 농도는 검출 한계 미만으 로 나타났다. 그러나 TTX 축적에는 개체 간, 지역적, 계 절적 변동 가능성이 존재할 수 있으므로, 한국 해역에서 붉은입두꺼비고둥의 TTX 축적 위험을 정확하게 평가하기 위해서는 추가적인 시료 확보와 계절별 연구가 요구된다.

본 연구에서는 국내산 양식 자주복의 테트로도톡신 및 그 유사체를 UHPLC-QqQ MS를 이용하여 분석하였다. 테 트로도톡신 분석법의 직선성과 일내 및 일간 정확도와 정 밀성, 검출 한계, 정량 한계를 구한 결과 CODEX 가이드라 인 기준에 적합하였다. 국내산 양식 자주복의 부위별 테트 로도톡신 함량을 분석한 결과 일부 시료의 간과 근육 부위 를 제외한 대부분의 시료에서 테트로도톡신이 검출되지 않 았으며, 검출된 시료도 간과 근육 부위에서는 각각 0.07 mg/ kg, 0.06 mg/kg의 낮은 농도로 테트로도톡신이 검출되었다. 테트로도톡신 유사체의 경우 국내산 양식 자주복에서 dideoxyTTX, trideoxyTTX, norTTX가 검출되었다. 이 중 dideoxyTTX는 국내산 양식 자주복의 모든 부위에서 주요 테트로도톡신 유사체로 확인되었다. 본 연구를 통해 국내산 양식 자주복의 테트로도톡신 및 그 유사체 분포를 이해 하는데 도움을 줄 수 있으며 국내 해양생물 독소 데이터베 이스 구축에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서는 국내산 검복의 테트로도톡신 및 그 유사체 를 UHPLC-QqQ MS를 이용하여 분석하였다. 테트로도톡신 분석법의 직선성, 검출 한계, 정량 한계, 정확성 및 정밀성을 확인한 뒤 국내산 검복의 부위별 테트로도톡신 함량을 분석 한 결과 대부분의 시료에서 테트로도톡신이 검출되었으며 정 소를 제외한 모든 부위에서 테트로도톡신이 검출되었다. 검 복의 테트로도톡신 함량은 난소에서 0.27-67.7mg/kg으로 가 장 높았으며 껍질과 간에서도 가식 부위인 정소와 근육에 비 해 높은 농도의 테트로도톡신이 검출되었다. 테트로도톡신 유 사체의 경우, 국내산 검복에서 4,9-anhydroTTX, deoxyTTX, dideoxyTTX, trideoxyTTX, norTTX가 검출되었으며 이 중 trideoxyTTX는 국내산 검복의 모든 부위에서 주요 테트로도 톡신 유사체로 확인되었다. 본 연구를 통해 국내산 검복의 테 트로도톡신 및 그 유사체 함량 및 조성을 이해하고, 국내 해 양생물 독소 연구에 해당정보가 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

테트로도톡신(tetrodotoxin, TTX)은 강력한 해양생물 유 래 신경독소로, 수산물 내 TTX를 검출하기 위해 기존에 주로 사용되는 mouse bioassay (MBA)와 LC-MS/MS 기법 은 낮은 검출한계와 동물 윤리 문제 등의 한계가 있어 이 를 대체할 새로운 시험법 개발이 필요합니다. Neuro-2a assay는 대표적인 세포기반 대체 시험법으로, 이 방법은 마우스 신경모세포인 Neuro-2a 세포주에 ouabain (O)과 veratridine (V)을 처리하여 과도한 Na+ 유입으로 인한 세 포 사멸을 유도한 후, Na+ 채널 억제제인 TTX가 Na+ 유 입을 차단해 세포를 보호하는 원리를 이용해 TTX를 정량 합니다. 본 연구에서는 Neuro-2a assay를 국내 실험실 환경에 적용하기 위해 TTX 처리 조건과 O/V 농도 등의 매 개변수를 최적화하였습니다. 그 결과, 최적 O/V 농도로 600/60 μM를 설정하였으며, S자형 용량-반응 곡선이 도출 되는 8가지 농도(50-0.195 ng/mL)를 확인하였습니다. 또한, 24번의 반복 실험을 통해 데이터의 신뢰도를 평가할 수 있는 6가지 data criteria를 확립하였으며, 이 중 EC50 값 은 약 3.824-1.268 ng/mL로 나타났습니다. 실험실 간 변동 성 비교 결과, COV+와 Bottom OD값을 제외한 모든 품 질 관리 기준(quality control criteria)과 데이터 기준(data criteria)의 변동계수(CVs)는 1.31-14.92%로 도출되어, 실험 의 적정성과 재현성이 확인되었습니다. 본 연구는 국내에 서 활용 가능한 TTX 검출용 Neuro-2a assay의 최적 조 건과 신뢰성을 평가할 수 있는 quality control criteria와 data criteria를 제시하였습니다. 아울러, TTX뿐만 아니라 유사체인 4,9-anhydroTTX에 대한 TEF 값을 0.2098로 산 출하여, TTX뿐 아니라 다양한 유사체의 검출이 가능함 을 확인하였습니다. 향후, 본 시험법은 국내 수산물 내 TTX 검출을 위한 MBA 대체법으로 활용될 것으로 기대 됩니다.

테트로도톡신(Tetrodotoxin)은 나트륨 통로를 차단하는 신경독소로 가장 오래되고 강력한 해양독소 중 하나이다. 전통적으로 아시아에서 복어 섭취로 인한 테트로도톡신 중독사고가 많이 발생했었다. 최근 아열대 복어 종과 그 잡종 섭취로 인한 테트로도톡신 중독사고가 아시아 외 지역에서도 산발적으로 발생하고 있다. 그러나 복어 종별 테 트로도톡신 및 유사체의 함량과 기관 내 분포에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 이 총설에서는 식품공전 복어독(테 트로도톡신) 분석법인 쥐를 이용한 생물학적 정량법, 효소 면역측정법, 고압 액체 크로마토그래피-형광검출기, 가스 크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석법의 장단점을 비교하였다. 또한 최근 주로 사용되는 액체 크로마토그래피-질량분석기를 이용한 테트로도톡신과 테트로도톡신 유 사체 분석법을 소개하고 이에 사용된 전처리법, 컬럼 및 이동상을 비교하였다. 또한 복어 종별 테트로도톡신과 그 유사체 함량과 다양한 기관에서의 분포를 정리하였다. 이 총설은 테트로도톡신 분석법과 다양한 복어 종의 테트로 도톡신과 유사체 함량 및 기관에서의 분포를 이해하는데 도움을 줄 수 있을 것이다.

The current standard for testing tetrodotoxin (TTX) in foodstuffs is the mouse bioassay (MBA) in Korea as in many other countries. However, this test suffers from potential ethical concerns over the use of live animals. In addition, the mouse bioassay does not test for a specific toxin thus a sample resulting in mouse incapacitation would need further confirmatory testing to determine the exact source toxin (e.g., TTX, STX, brevotoxin, etc.). Furthermore, though the time of death is proportional to toxicity in this assay, the dynamic range for this proportional relationship is small thus many samples must be diluted and new mice be injected to yield a result that falls within the quantitative dynamic range. Therefore, in recent years, there have been many efforts in this field to develop alternative assays. High performance liquid chromatography (HPLC) coupled with mass spectrometry (MS) has been emerged as one of the most promising options. A LC-MS-MS method involves solid-phase extraction (SPE) and followed by analysis using an electrospray in the positive ionization mode and multiple reactions monitoring (MRM). To adopt LC-MS-MS method as alternative standard for testing TTX, we performed a validation study for the quantification of TTX in puffer fish. This LC-MS-MS method showed good sensitivity as limits of detection (LOD) of 0.03~0.08 μg/g and limits of quantification (LOQ) of 0.10~0.25 μg/g. The linearity (r2) of tetrodotoxin were 0.9986~0.9997, the recovery were 80.9~103.0% and the relative standard deviations (RSD) were 4.3~13.0%. The correlation coefficient between the mouse bioassay and LC/MS/MS method was higher than 0.95.