소나무재선충(pine wood nematode, PWN) 감염 소나무를 현장에서 신속하게 진단을 할 수 있는 방법은 현재 없다. 본 연구에서는 PWN특이적인 항원으로 알려진 PWN-GaLectin을 baculovirus발현체계로 발현시켜서 총 1,464개의 fusion hybridoma 세포 주 라이브러리 를 제작 하는 항원으로 이용하였다. 총 1,464개의 fusion hybridoma 세포 주 중, PWN-GaLectin에 대한 높은 반응을 보이는 62개의 fusion hybridoma 세포 주를 선별했다. 이들 중, 표준 PWN 감염소나무 PBS추출물과 PWN 단백질 추출물에 강한 반응을 보이는 세포 주 12개를 선 별하여 단클론 항체(monoclonal antibody, Mab) 분비세포 주 확립을 위한 limited dilution을 실시하였다. Mab분비세포 주 확립을 위해서 표 준 PWN 감염소나무 추출물에 대한 반응이 표준 정상 소나무 추출물 보다 높은 세포 주들을 선별했다. 그리고 추가로 PWN 단백질 추출물에 대 해서 3종의 비 병원성 선충 단백질 추출물 보다 높은 반응을 보이는 세포 주들도 선별, 확립했다. 본 연구에서 확립된 Mab들을 우리는 현장과 실 험실에서 사용할 수 있는 신속진단키트의 개발에 이용할 수 있을 것이다.

소나무 재선충은 현재 가장 심각한 산림해충으로 확실한 방제방법이나 진단방법이 개발되지 않은 상태이다.다양한 연구가 이루어 졌지만, 재선충 감염 소나무에서 어떠한 변화가 일어나는지에 대한 연구가 이루어지지 않았다.본 연구에서는 재선충 감염소나무에 존재하는 특이 항원들을 발굴하는 연구를 진행하였다. (Title: Developmentof Bursaphelenchus xylophilus detection techniques by using its specific antigens and antibodies. No. 12178-0279-01)

경기도 광주시 국유림에서 잣나무 고사목을 수집하여 국립산림과학원 내 밀폐된 항온항습실에서 우화 시킨 북방수염하늘소 42개체(암 24, 수 18)를 Flight Mill에 걸고 3주간 3~4일 간격으로 총 7회, 개체 당 30분 동안 비행능력을 실험하였다. 실험결과 누적비행거리는 암컷이 평균 861.9m(최대 4,200m)이었고, 수컷은 평균 1,249m(최대 3,500m)으로 수컷이 암컷보다 더 많은 거리를 비행하였다. 1회 비행거리는 암컷(평균 329.2m)이 수컷(295.2m) 보다 더 많은 거리를 비행하였다. 비행빈도는 전체적으로 수컷이 높게 나타났는데, 암컷의 경우 우화 후 17일이 지난 후 빈도가 이전보다 2배 이상 높아졌다. 반대로 수컷의 경우 17일까지 높은 비행빈도를 보였으나 17일 이후로는 낮은 빈도로 비행하는 것이 확인되었다. 총 30분의 비행 동안 단거리를 여러 차례에 걸쳐 비행하는 개체는 수컷이 암컷보다 2배 이상 많은 것으로 나타났다. 비행능력과 개체 수명 및 섭식능력의 관계성은 나타나지 않았지만, 우화 후 7일을 기점으로 일 평균 섭식량은 감소하는 경향을 보였다

용매추출법에서 희토류 금속을 효과적으로 분리하기 위해 추출제만 사용하는 것이 아니라 crown ether와 같은 첨가제를 이용하는 연구를 하였다. Host-guest 화합물인 macrocyclic ligand는 금 속과 착화물을 형성하는데, 이 때 crown ether의 cavity 크기와 비슷한 크기의 금속 이온들과 안정한 착 화물을 형성한다. 이전 연구에서 europium과 yttrium을 분리하기 위해 여러 사슬 길이의 지방산 추출제 를 이용한 추출실험을 행하였었다. 이를 토대로 분리효율이 좋지 않았던 hexanoic acid에 크기가 다른 crown ether (18-crown-6 ether, 15-crown-5 ether, 12-crown-4 ether)를 첨가하여 분리효과가 증가 하는 것을 연구하였다. hexanoic acid의 농도별로 분리효율을 본 후 가장 분리 효율이 좋은 농도에서 crown ether를 종류와 농도를 다르게 하여 첨가하였다. 그 결과 0.05 M hexanoic acid에서 분리능이 1.72으로 가장 높게 나타났고, crown ether를 첨가하였을 시 분리능이 0.002 M 15-crown-5 ether에서 가장 높게 나왔으며 기존의 분리능보다 2배 이상 더 높았다. 또한 crown ether를 첨가하였을 때 두 금 속이 MLR3·3RH의 형태로 추출되는 것도 확인 할 수 있었다.

잣나무림에서의 재선충병 발병양상을 분석하기 위하여 재선충병 피해지인 성남지역에 고정조사구를 선정(면적 1ha)하여 매월 주기적으로 감염목 발생상황을 조사하였다. 감염목의 시기별 고사율을 조사한 결과, 감염당해연도인 11월에 42.5%로 가장 높았으며, 7월에는 19.4%가 고사, 이듬해 5월에 2.4%로 가장 낮았다. 2013년 3월 중순, 재선충병 감염목의 고사시기에 따른 부위별 선충밀도 및 분포 상황을 분석한 결과, 감염 당해 연도인 7월부터 11월에 고사한 잣나무에서는 전부위에서 소나무재선충이 검출되었다. 그러나 이듬해인 1∼3월에 고사한 잣나무의 경우 수간하부에서는 거의 검출되지 않았으며 9m이상의 상부에서만 분포하였다. 고사시기별 매개충의 분포 양상을 조사한 결과, 9월 이전에 고사한 잣나무에서만 산란하였으며, 그 이후에 병징이 나타나는 감염목에는 산란하지 못한 것으로 조사되었다. 피해지 내 건전목의 하부고사가지에서의 매개충 산란 및 재선충 분포여부를 조사한 결과, 하부고사지 중 매개충이 산란 및 서식하는 가지는 전체 조사 가지 중 약 3.3%였다. 또한 매개충의 서식가지에서 소나무재선충을 분리한 결과 20%이상에서 소나무재선충이 검출되었다. 이 결과를 토대로 잣나무림에서의 소나무재선충병 방제 시 건전목의 하부 자연 고사지까지 완전히 제거하여야만 완벽한 방제효과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.

해송묘목에 있어서 소나무재선충과 어리소나무재선충의 이동, 증식 및 세포파괴의 양상을 조사하기 위하여 다음과 같은 실험을 행하였다. 먼저 해송의 묘목에 소나무재선충과 어리소나무재선충(아시아형 또는 유럽형)을 접종하여 고사율을 측정한 결과 접종 25주 후, 소나무재선충 접종 묘목의 고사율은 90%, 아시아형과 유럽형 어리소나무재선충을 접종한 묘목의 고사율은 증류수를 접종한 대조구와 같이 0%였다. 이 결과로부터 어리소나무재선충은 병원성이 없는 것으로 확인되었다. 이 두 선충 종 사이에 병원성 차이를 가져오는 요인을 알기보기 위해 해송 가지를 20cm 길이로 잘라서 소나무재선충과 어리소나무재선충(아시아형 또는 유럽형)을 인공접종한 후 선충의 가지 내 이동, 증식과 세포가해양상을 조사하였다. 가지 내 수직 이동은 소나무재선충과 어리소나무재선충 사이에 차이가 없었으나 증식률은 소나무재선충이 두 종류의 어리소나무재선충 보다 유의하게 높다는 것을 알았다. 한편, 증류수를 접종한 대조구의 경우 7일 후까지도 해송 가지의 피층수지도 내부에 죽은 상피세포가 거의 존재하지 않았으나, 소나무재선충 접종구의 경우, 접종 7일 후 까지 죽은 상피세포가 피층수지도 내에 산재 분포하였다. 죽은 상피세포의 밀도는 접종 일수가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였다. 또한 소나무재선충 접종구의 세포파괴 정도가 어리소나무재선충의 접종구 보다 심했다. 소나무재선충의 병원성은 소나무재선충의 높은 증식력과 높은 가해력에서 기인한다는 것을 알았다.

소나무재선충속(Bursaphelenchus) 선충은 전 세계적으로 100여종이 기록되어 있으며 대부분 종은 식균성 선충(mycophagous)으로 주로 죽은 식물체나 죽은 목재 조직에서 서식한다. 다만, 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)과 같이 일부 종의 경우 살아있는 나무와 죽은 나무 모두에서 식물기생성 시기(phytophsgous phase)와 식균성 시기(mycophagous phase)를 순환하는 선충도 있다. 소나무재선충속 선충의 분류 방법은 크게 형태적인 특징과 분자생물학적인 특징으로 나눌 수 있으며, 각각의 방법은 다양한 기준과 요소로 세분화되어 진다. 형태적인 특징으로는 ‘수컷의 생식기 형태’를 비롯하여, ‘수컷 미부 돌기의 배열’, ‘암컷 생식기 구조’, ‘암컷 꼬리 모양’, ‘측정치’등을 들 수 있다. 독일의 Braasch(2000)는 이에 ‘측선의 수’, ‘수컷 bursa의 모양’등을 추가하여 28종의 Bursaphelenchus속 선충을 10개의 그룹으로 분류하였다. 한편 Ryss등(2005)은 수컷 생식기에 대한 측정치를 산정함으로써 형태적인 분류를 보다 수치적으로 체계화하는데 성공하였다. 분자생물학적인 분류를 위하여서는 라이보좀 DNA(ITS, D2D3, SSU), 미토콘드리아 DNA 등이 활용되고 있으며, 이들 중 일부는 종 동정을 위한 유전자 마커로 개발되었고 또 일부는 계통 분류학적 근연관계를 파악하기 위한 정보로 이용되고 있다. 소나무재선충속 선충 종에 있어서 유전적 특성과 형태적 특성간의 차이를 조사하고자 한다.

우리나라에서 소나무재선충병이 1988년 부산에서 최초 발생한 이후 점차적으로 피해가 확산됨에 따라 급기야 2005년에 ｢소나무재선충병 방제특별법｣을 제정‧시행하고 범 정부적 노력으로 감소하였으나, 2011년부터 확산 추세를 보여 2014년 현재까지 63개 시·군·구로 확산되었다. 피해고사목의 발생 추이는 ’11년 477 → ’12년 506 →’13년 1,231천본으로 증가되었다. 소나무재선충병 피해확산 요인으로는 매개충 우화기 이전에 피해고사목 전량방제 미실행과 여름철 이상고온 및 가뭄으로 매개충(솔수염하늘소, 북방수염하늘소)의 개체수와 활동이 급격히 증가하여 피해가 확산된 것으로 추정된다. 또한 피해 관할 지자체의 관심부족과 전담인력 부재로 피해범위가 확대되고, 소나무류 인위적 이동에 따른 신규발생 지역이 증가하였다. 2013년 신규발생지은 광주 광산구, 울산 동구, 경기 양평‧하남‧연천‧가평‧양주‧안성, 강원 춘천, 충북 충주, 경북 상주이며, 2014년에는 경기도 의왕, 강원도 정선, 전북 순창, 경북 경산에서 발생하였다. 신규발생지 역학조사를 실시한 결과 울산 동구, 경기 하남, 경북 상주는 자연적 확산, 기타지역은 인위적 확산으로 밝혀졌다. 이러한 인위적인 확산은 어느 지역에서 그 피해가 발생할지 예측할 수 없기 때문에 조기예찰과 적기방제가 어려워 피해지역이 점점 증가 하고 있는 실정이다. 따라서 재선충병 피해현장에서 철저한 방제작업과 우리나라의 경우 소나무의 중요성 때문에 소나무 배제정책이 아닌 소나무 살리기 운동이 정책적으로 이루어진다면 소나무재선충병 방제가 충분히 가능할 것이다.

소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 매개충인 솔수염하늘소 (Monochamus alternatus)와 북방수염하늘소 (Monochamus saltuarius)는 생물학적 뿐만 아니라 형태적으로도 비슷하다. 특히, 유충의 형태를 육안으로 구별하기가 용이하지 않다. 우리가 디자인한 Intermal transcribed spacer(ITS) 유전자 마커를 이용하여 지역별 로 매개충들의 분포를 알아보았다. 개발한 ITS primer는 PCR을 통하여 유전자 마 커로서의 기능을 확인하였고, 이 실험을 입증하기 위하여 실험에 사용했던 유충들 을 성충으로 사육한 결과 PCR 실험과 같은 결과를 나타낸 것을 확인하였다. 이러 한 ITS PCR method를 이용하여 지역별 매개충 분포를 조사하였다. 소나무재선충 병 피해지에서 매개충 유충을 채집하여 PCR을 실행하였다. 그 결과 경기도는 북방 수염하늘소, 대구는 솔수염하늘소, 충남과 경북은 솔수염하늘소와 북방수염하늘 소가 혼생되어 있는 것을 확인하였다. 더 나아가 이 방법을 이용하여 신규발생지역 에서 나타난 매개충의 종류를 유충상태에서 미리 파악이 가능하며, 두 매개충이 혼 생하는 지역을 확인하여 예방 및 방제를 할 수 있을 것이라 생각된다.

A survey was conducted to find out the major plant parasitic nematode in Chrysanthemum morifolium fields in Korea from May to June in 2005. A genus of Pratylenchus was determined as the most important plant parasitic nematode based on analysis of total 50 samples from 8 cities of chrysanthemum field. Pratylenchus showed 86% occurrence rate and average numbered 1,095 per 200㏄ soils and Ig root. Five Pratylenchus isolates, "Muan", "Masan", "Tean", "Gumi", "Jeongup", were selected for the molecular identification of the species of Pratylenchus, and ITS and D3-28S ribosomal DNA were amplified by PCR. For the ITS, only" Muan" isolate was differentiated by total 1 kb PCR amplification, which was 200 bp larger than all the other isolates. There was no size variation in amplified D3-28S rDNA and all isolate represented approximately 320 bp of PCR product. Sequence data of D3-28S rDNA were analysed by MegAlign program in DNASTAR software and phylogenetic tree was constructed. Sequence homology was 100% between "Gumi" isolate and "Tean" isolate and "Jeongup" isolate was also close to these isolates by 99.7% sequence homology. "Gumi", "Tean" group and "Jeongup" isolate were determined to be closely related to Pratylenchus vulnus by 96.7% and 96.3% similarity in respectively. D3 sequence of "Masan" isolate was 100% identical to P. penetrans, and "Muari" isolate showed 99.7% similarity to P. brachyurus. This result was congruent with the branch divergence pattern shown in phylogenetic tree.

본 연구는 뿌리썩이선충(Pratylenchus vulnus)이 옥수수뿌리조직을 침입했을 때, 조직의 해부학적.생화학적 변화를 밝힘으로써 식물과 선충의 상호관계를 이해하고, 이들 정보를 바탕으로 선충저항성 작물의 육종 및 선별에 활용하기 위함이다. 옥수수뿌리 표피를 뚫고 들어온 선충은 뿌리 피층에 자리를 잡고, 세포벽을 파괴하면서 다른 세포로 이동한다. 마침내 선충들은 피층의 내피와 세근의 기부에 밀집했다. P.vuinus의 암컷들은 세포내에 공간(cavity)을 형성하여 그 속에 알을 낳는 습성을 지니고 있다. 선충에 의한 주된 피해양상은 세포벽이 파괴되고 부서져서 공간을 형성하는 것으로 나타난다. 이러한 현상은 세근의 기부에서도 관찰된다. 선충의 피해로 야기된 옥수수 뿌리의 생화학적 변화는 선충접종구와 무접종구간 총단백질양과 esterase활력조사를 통해 비교.분석되었다. Denaturing gel 상에서 총단백질양의 비교는 유의한 차이를 나타내지 않았고, esterase 의 pattern 및 활력에서도 유의할 만한 차이는 발견되지 않았다.