The objectives of this study was to evaluate the efficiency of the bacteria eliminated sperm by percoll gradient method on sperm quality and embryo cleavage in vitro in pig. The semen of miniature pig collected by gloved-hand method pre-warmed (37℃) in thermos bottle, and separated by 65% percoll. Analysis of sperm ability was estimated by examining viability, capacitation and acrosome reaction using chlortetracycline (CTC) and the abnormality. Also, fertility of sperm was monitored with cleavage rate of embryo after IVF using separated and un-separated sperm by percoll. The result, viability of separated sperm was significantly(p<0.05) higher(83.6±2.0 vs 59.0±4.4%) than un- separated sperm. The results of CTC analysis showed the percentage of F- and B-patterned separated sperm was higher in separated that than un-separated sperm. On the contrary, the percentage of AR-patterned form un-separaed sperm was significantly(p<0.05) higher(13.6±0.8 vs 8.1±0.6%) than separated sperm. Also, abnormality of un-separated sperm was significantly(p<0.05) higher(20.2±0.4 vs 16.8±2.8%) than separated sperm. However, the cleavage rates of embryo using separated sperm by percoll and un-separated sperm had not significantly difference on 2 cell stage(9.25 vs 11.88%), 4 cell stage(26.76 vs 24.51%) and >4 cell stage(63.99 vs 63.61%) at 48h of IVF. Therefore, the sperm separated by percoll method showed improvement in sperm quality than un-separated sperm in miniature pig.

This study was performed to confirm the microtubule assemblies and methylation patterns of porcine IVF and parthenogenetic embryos. Cumulus-oocyte complexes were collected and matured in vitro for 42 hr. Oocytes were fertilized by prepared fresh sperm or activated parthenogenetically by exposure to electric stimulation and 6-dimethylaminopurine. Porcine IVF and parthenogenetic embryos were cultured in vitro for 6 days. Embryos were stained by immunofluorescence staining method to observe the dynamic of nucleus and microtubules in the first mitotic phase and the methylation patterns in different developmental stages. After then, samples were confirmed and analyzed through a laser-scanning confocal microscope. IVF embryos had a centrosome originated from sperms, which was shown a ɤ-tubulin spot. However, ɤ-tubulin spot was not observed in parthenogenetic embryos. A lower methylation level was observed in IVF embryos compared to parthenogenetic ones at the morula and blastocyst stages. In conclusion, it is considered that microtubule assemblies and genetic regulation mechanism differ between parthenogenetic and IVF embryos.

We attempted to control the maturation promoting factors (MPF) activity and nuclear remodeling of somatic cell nuclear transfer (NT) bovine embryos. Bovine ear skin fibroblasts were fused to enucleated oocytes treated with either 5 mM caffeine for 2.5 h or 0.5 mM vanadate for 0.5 h and activated. The nuclear remodeling type of the reconstituted embryos was evaluated 1.5 h after activation. MPF activity was assessed in enucleated and chemical treated oocytes before the injection of a donor cell. Effect of chemicals on the embryonic development was evaluated with parthenogenetic embryos. MPF activity increased significantly by caffeine treatment, but decreased by vanadate treatment (p<0.05). Caffeine or vanadate had no deleterious effect on the parthenogenetic embryo development. In caffeine treated group, premature chromosome condensation (PCC) was occurred in 72.2% of NT embryos (p<0.05). In contrast, vanadate induced the formation of a pronucleus-like structure (PN) in a high frequency (68.9%, p<0.05) without PCC (NPCC). Blastocyst development of NT embryos increased by treating with caffeine (30.3%), whereas decreased by treating with vanadate (11.4%) compared to control (22.1%, p<0.05). The results indicate that caffeine or vanadate can control of MPF activity and remodeling type of NT embryos, resulting in the increased or decreased in vitro development.

This study was conducted to investigate the effect of periods of sperm preincubation, concentrations and storage periods of miniature pig sperm on in vitro penetration of porcine follicular oocytes. High concentration (1×105, 2.5×105, 5×105, 1×106, 5×106 and 1×107) did support sperm penetration than low concentrations (P<0.05). However, polyspermic oocyte rates were increased with high concentrations of sperm. On the other hand, sperm preincubated during 1, 2 or 5h could be penetrated than sperm preincubated during 0, 3 or 4h (P<0.05). When sperm were storaged with different periods, in vitro pentration rates were significantly higher 0～2 days than 3～4 days of sperm storage (p<0.05). These results indicate that sperm treatment factors can effect in vitro penetration in miniature pig.

The aim of this study was to evaluate the effects of orvus es paste(OEP) on the sperm characteristics during freezing in boar semen. Semen quality was evaluated the motility, membrane integrity, mitochondria function, acrosome status, viability and abnormality. Boar semen were frozen until 5℃ for 2 hours using cell freezer and making the straws, and then freezing by lowing the straws into styrofoam box on the 8cm above the LN2 and plunged into LN2 for cryopreservation. In different concentration of OEP (0, 0.25, 0.5 and 1.0%) into cryo-extender, sperm motility, membrane integrity, acrosome status, viability and mitochondria function were significantly higher in 0.5% OEP than those of any other groups, but sperm abnormality were highest in 1.0% OEP group among all treatment groups (P<0.05). In the relationships of the evaluation methods for sperm viability, CBB vs membrane integrity, CBB vs HO/PI and CBB vs mitocondria function were positively correlated (0.67~0.92). Among the evaluation methods, CBB vs membrane integrity, CBB vs HO/PI and CBB vs mitocondria function were significantly correlated (P<0.001). These results of this study indicate that supplementation of 0.5% OEP in boar semen cryo-extender can improve the semen quality.

본 연구는 0.5 ml straw를 이용한 정자 동결융해 시 융해 온도가 동결정자의 성상에 미치는 영향을 파악하고 미니 돼지의 동결정액에 최적화된 적정 융해 조건을 찾기 위하여 실시하였다. 정액동결 straw를 37, 50 및 70℃에서 각각 5초, 10초 및 45초간 융해하여 생존율(SYBR-14/PI staining), 정자원형질막기능검사 (Hypoosmotic Swelling Test) 및 첨체반응율 (CTC : chlorotetracycline staining)을 검사 한 결과 70℃에서 5초간 융해한 정자의 생존율과 CTC 결과가 37℃와 50℃에서 10초 및 45초간 융해한 처리구보다 유의적(p<0.05)으로 높은 생존율과 낮은 비율의 첨체 반응율을 얻었다. 따라서 미니 돼지의 동결 정액은 고온에서 단시간 융해를 하는 것이 정자의 성상에 유리한 것으로 사료된다.

본 연구는 소 체외수정란과 체세포 복제란의 초자화 동결 및 융해 후 생존능을 검토하였다. 배반포로 발육된 체외수정란 및 체세포 복제란을 초자화 동결법에 의해 동결하였다가 융해하여 생존율 및 배양 후 부화율을 검사하였다. 체외수정란 배반포를 초자화 동결 융해한 결과, 확장배반포가 배반포기 난자에 비하여 생존율(82.1%, 96/117)과 부화율(64.1%, 75/117)에서 모두 유의적으로 높았다(p<0.05). 핵이식 배반포 복제란을 초자화 동결 융해한 경우도 체외수정란과 비슷한 경향을 보여 확장 및 부화배의 생존율과 부화율이 각각 81.1%(30/37)와 78.3%(29/37)로, 배반포(각각 71.8 및 53.8%)에 비하여 다소 높게 나타났다. 본 연구의 결과는 초자화 동결 방법에 의해서 소 체외수정란과 체세포 복제란을 성공적으로 동결할 수 있으며, 특히 후기 배반포기 단계에서 초자화 동결 시 높은 생존율과 부화배 형성율을 얻을 수 있음을 보여준다.

본 연구는 미니 돼지와 일반 돼지(Duroc)의 동결융해 후 정자의 수정 능력을 비교하여 동결 보존체계의 기틀을 확립하고자 하였다. 정액 제조는 수압법으로 정액 채취하여 1차 희석하였다. 동결은 LEY (1차: 11% -lactose+egg yolk, 2차: 1차 동결액+glycerol+OEP) 동결액을 이용하여 동결을 실시하여 동결 보존하였다. 동결 정액의 융해는 0.5 ml straw를 각각 20, 37 및 water bath에서 1분, 40 초 및

본 연구는 내분비계 장애물질인 BPA와 DEHP가 돼지 정액 성상(운동성, 생존율, 원형질막의 정상성, 기형율)에 유해한 영향을 미치는지를 검토하였다. 일정 농도로 희석한 돼지 정액에 BPA와 DEHP를 각각 0, 1, 10, 100 μM의 농도로 처리하여 3, 6, 9시간 동안 체외배양을 실시하였다. BPA 처리에 따른 운동성과 생존율은 체외배양 시간과 첨가농도에 따라 감소하였으며, 체외배양시간이 경과함에 따라 대조구와 명백한 차이를 나타냈다. 100 μM의 농도로 처리한 경우의 운동성과 생존율은 체외배양시간에 관계없이 처리군이 대조구에 비해 유의적으로 감소하였다(p<0.05). DEHP 처리에 따른 정자의 운동성과 생존율도 체외배양시간과 첨가농도에 따라 감소하여 BPA의 성적과 유사한 경향을 나타냈다. 정자원형질막의 기능성은 배양시간에 따라 감소하였으며 BPA 및 DEHP 첨가농도 간에 차이가 인정되었으며, 특히 100 μM 처리구에서 급격히 감소하는 성적을 나타났다. 정자의 기형율은 BPA 및 DEHP 처리시간 및 농도에 크게 영향을 받지는 않았다. 본 연구의 결과로 볼 때, 고농도의 BPA와 DEHP(>10 μM)에 정자의 장시간 노출은 유해한 영향을 줄 것으로 사료된다.

본 연구는 융합 전 수핵란의 활성화 처리 유무와 활성화 처리 시간이 소 체세포 유래 핵이식란의 체외 발육능에 미치는 영향을 검토하기 위해 수행하였다. 소 체외성숙란의 탈핵 후 체세포 핵을 이식하고 일부는 전기 융합 후 활성화를 유기하였고(pre-AC), 일부는 먼저 활성화 처리 후 융합을 실시(post-AC)하였다. 난자의 활성화는 Ca2+-ionophore(A23187)로 처리 후 DMAP로 4시간 배양하는 방법으로 유기하였다. 핵이식란은 CR1aa액에서 9일간 배양하여 발육율을 검토하였으며, 활성화 후 30분～2.5시간에 고정하여 confocal microscope 하에서 핵형 변화를 검사하였다. 배반포기까지 발육율은 post-AC구(20.6%)가 pre-AC(15.3%)보다 다소 높게 나타났다. 또한 활성화 처리를 하여 핵이식란의 배 발달을 비교한 결과 post-AC구가 더 늦은 배 발달 속도를 나타내었다. Post-AC구를 활성화 후 30분, 2시간, 4시간으로 나누어 융합하여 발육율을 검토한 결과 발육율에 차이가 없었다. 본 연구의 결과는 수핵란의 활성화 시간에 따라 핵이식란의 발육 및 핵형이 영향을 받을 수 있음을 시사한다.

본 연구는 돼지정액의 보다 간편하고 손쉽게 동결시킬 수 있은 방법을 확립하기 위하여 수행하였다. 돼지정액은 3시간에 걸쳐 5℃까지 냉각 후 Straw에 봉입하고 다양한 방법 및 step에 의해 스티로폼 용기 내에 들어있는 LN2 중에서 동결하였다. 정자의 생존성은 LN2 표면으로부터 10 cm 위에서 10분간 정치 후 침적할 경우 가장 높게 나타났다(54.0%). Straw를 -102℃에서 10분간 정치시킨 처리구가 여타구보다 높은 생존성이 얻어졌다(74.0%, P<0.05). 응해 방법에 따른 동결정액의 생존성 실험에서는 37℃의 융해구가 52℃ 융해구보다 유의적으로 높은 결과를 나타냈다(P<0.05). 1단계 동결 방법과 3단계 동결방법으로 돼지 정액을 동결시킨 결과 정액의 일반적 특성 및 첨체의 이상 유무를 평가하는 CTC 검사에서는 커다란 차이가 인정되지 않았다. 동결정액을 이용한 체외수정 결과에서는 상실배기 이상 발육율에서 1-step이 3-step보다 높은 발육율을 나타내었다(27.5 vs 14.7%, P<0.05). 본 실험의 결과 돼지정액 동결 시 -102℃에서 10분간 정치시키는 1단계 동결방법이 간편하면서 유리한 동결 방법으로 활용될 수 있음을 보여준다.