The present study was performed to evaluate the best electric fusion condition in nuclear transfer, Korean Native Cattle fibroblasts were used as nucleic donors. Oocytes from slaughterhouse were matured in vitro for 22 h and enucleated. Each individual cells were transferred into enucleated ocytes and reconstructed embryo were placed into the fusion chamber. In experiment 1, pulse were performed by altering pulse duration at 1. 75kv/cm, 1 time. When pulse duration is 30, fusion and development rates is higher than other conditions. In experiment 2, the effect of different pulse number were studied at the pulse duration 30 and the same pulse intensity. When pulse number was one, fusion rates were higher than other conditions. The fused embryos were moved to culture medium and assessed their development to blastocyst. These results showed that best fusion condition was 30 and one time. And the fibroblasts derived from Han Woo can be reprogrammed by nuclear transplantation and develop subsequently in vitro.

The development potential of bovine somatic cells was evaluated using nuclear transfer. A single donor cell derived from fetus of HanWoo(Korean Native Cattle) was selected and deposited into perivitelline space of each enucleated oocyte before electrical fusion and activation. Nuclei of donor cells starved for 7 days (37%) tended to support the development of reconstitute embryo the blastocyst stage better than those of donor cells starved 3, 14 and 30 days. The cleavage rate was significantly lower(P<0.05) in reconstitute embryos derived from large size donor cells(51.2%), than those from small medium size donor cells(76.6 and 73.5, respectively). The developmental rate to blastocyst of reconstructed embryos from medium size donor cells was higher than those from small and medium size donor cells. This study demonstrates that an appropriate culture period for induction into quiescent stage and the size of donor cells effect on the efficiency of nuclear transfer using cultured bovine cells.

흰쥐의 뇌로부터 읽는구조 전체를 포함하는 1.8kbp 크기인 IP_3K를 암호화 하는 IP_3KcDNA 유전자속의 NotⅠ부위 GCGGCCGC를 GCAGCCGC로 site-directed mutagenesis 하여 얻은 변이 IP_3KcDNA를 pSP72·Not2 운반체의 EcoR I 부위에 클로닝하여 증폭시키고, 유전자 재조합 과정을 거쳐서 포유동물의 발현 운반체인 pZIP·NeoSV(X)의 NotⅠ부위에 IP_3KcDNA를 서브클론하였다. 이것을 CCL39 hamster lung fibroblasts 세포에 transfection 하여 발현시키고, anti-IP_3K antibody를 사용하여 Western blot 법으로 효소량과 활성도를 각각 측정한 결과, 효소량은 5배, 효소의 활성도는 무려 16배로서 기대하였던 것보다 훨씬 발현효율이 높았다. 또한 흰쥐의 각 조직속에 IP_3K의 분포와 생화학적인 특성이 논의되었다.

Background: This study were to investigate the effect of Pediococcus pentosaceus fermented Radix astragali (AMRP) and non-fermented products (AMRNP) on collagen synthesis in the cultures of human dermal fibroblasts, and their inhibitory effects on the matrix-degrading enzymes (collagenase, elastase, and gelatinase). Methods and Results: Both AMRP and AMRNP significantly improved cell growth and proliferation of HDF cells. However, the enzyme-linked immunosorbent assay and Western blot analysis demonstrated that AMRP, but not AMRNP, significantly and dose-dependently stimulated the biosynthesis of type I procollagen in both aged (74 y) and young (21 y) HDF cells. Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction revealed that expression of type I, type III procollagen and transforming growth factor β1 (TGF-β1) mRNA was significantly stronger in AMRP-treated HDF cells than that of AMRNP-treated and un-treated HDF cells. The AMRP revealed an increase in astragaloside Ⅳ only depending on increase in fermentation period, because other astragalside converted to astragaloside Ⅳ, which it detached acyl group by fermentation processing of Pediococcus pentosaceus. Conclusion: The results also suggested that AMRP could stimulate the collagen biosynthesis in human dermal fibroblasts, which is, associated with the regulation of procollagen biosynthesis resulting from AMRP-induced TGF-β1 expression and the mitogenic activity in HDF cells, and therefore, is expected to reduce the age-dependent loss of extracellular matrix proteins.

피부 손상은 주로 자외선, 열, 담배 등과 같은 환경적 요인으로부터 초래되는데, 이는 활성산소종의 과생 성으로 인한 피부노화와 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 돌배(Pyrus pyrifolia NAKAI)는 전 세계적으로 많이 소비되는 과일로써 항암, 항산화, 항염증효과가 알려져 있다. 본 연구에서는 돌배나무잎 추출물(Pyrus pyrifolia leaf extract, PPE)의 ultraviolet B (UVB)스트레스에 대한 피부 섬유아세포 보호효과를 검증하였다. Lactate dehydrogenase assay와 DCF-DA를 이용한 정성분석 실험은 PPE가 인간의 섬유아세포에서 UVB 스트레스 에 의해 유발된 세포독성 및 과생성된 활성산소종을 농도 의존적으로 억제할 뿐만 아니라, 미토콘드리아 기능저 하, 막전위 저하, 그리고 세포사멸과정의 핵심 인자인 caspase-3 활성도 유의하게 억제함을 보여주었다. 결론적 으로, PPE는 UVB스트레스에 의해 과생성된 활성산소종을 억제시켰으며, 이로 인해 생기는 피부세포 사멸을 효과적으로 저해함을 확인하였다.

극심하고 지속적인 자외선에의 노출은 정상적인 피부구조를 파괴하는 다양한 피부 광노화 과정을 야기한 다. 자외선은 인체 피부에서 세포외기질의 구성성분을 분해시키는 기질 분해효소인 matrix metalloproteinases (MMPs)의 발현을 활성화시키고, 콜라겐 합성은 감소시킴으로써 피부의 탄력과 구조적 치밀도를 약화시켜 궁극 적으로 피부주름을 생성한다. 본 연구에서는 이러한 피부 광노화 현상을 완화시키는 소재로서 영실의 효능을 검증하고자 하였다. 먼저 인간 섬유아세포주인 Hs68을 이용하여 영실의 세포증식 촉진효능을 확인하였다. 여기 에 더해 영실이 activator protein (AP)-1 전사인자의 억제를 통해 MMP의 발현을 감소시킴을 mRNA 및 단백 질 수준에서 검증하였다. 또한, 진피층을 구성하는 타입 Ⅰ형 콜라겐과 표피-진피 경계부를 단단히 고정시키는 역할을 하는 타입 Ⅳ형 콜라겐 역시 영실에 의해 발현이 증가하며, 자외선에 의한 염증반응의 억제에도 영실이 효과적으로 작용하는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 본 연구를 통해 영실이 자외선에 의한 피부노화와 주름 생성을 효과적으로 개선할 수 있는 가능성을 가짐으로써 항노화, 항염증 및 항주름 소재로서 화장품에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

피부는 낮 동안 태양빛과 인공 빛에 끊임없이 노출되어 있으며, 그중 5%는 UV 영역, 50%는 가시광선, 나머지 45%는 적외선 영역으로 구성되어 있다. 이중 자외선의 피부에 대한 영향은 많은 연구가 되어 왔으나, 나머지 영역에 대한 연구는 미진한 실정이다. 이에, 가시광선에서 적외선 사이의 파장이 피부 섬유아세포에 어떤 영향을 미치는지 연구하고자 하였다. 광처리에 의한 효과는 광파장, 처리 시간, 광세기, 광조합 등 다양한 파라미 터들의 조합에 의해 그 효능이 결정되므로, 본 연구에서는 섬유아세포의 성장 및 콜라겐 합성과 관련된 기능을 촉진시킬 수 있는 광처리 조건을 찾아내고자 하였다. 가시광선과 적외선 영역 사이의 6개의 파장을 처리한 결과, 레드(630 nm)와 그린(520 nm) 파장에 의해 섬유아세포의 증식이 증가함을 확인하였다. 광처리 시간은 콜라겐 합성량 증가를 위해서는 10 min의 광처리가 30 min의 광처리 보다 적합한 조건이었다. 광세기는 0.05 ∼ 0.75 mW/cm2에서 6개의 광세기로 분할하여 실험한 결과, 레드 0.3 mW/cm2와 그린파장 0.15, 0.3 mW/cm2 세기가 type I collagen의 mRNA의 양을 증가시킬 수 있었다. 마지막으로 두 개 파장을 순차적으로 조합 처리하였을 때의 효과를 확인한 결과, 레드와 그린파장의 조합 조건은 섬유아세포의 수적증가를 목적으로 할 때 효율적인 방법이며, 콜라겐 합성에는 레드 단독처리가 보다 효과적인 방법이었다. 따라서 본 연구에서 제시하는 광처리 조건을 이용시 피부 세포의 성장이나 콜라겐 합성에 긍정적 영향을 유도할 수 있으며, 재생 및 피부 미용 등에 활용할 수 있는 가능성이 클 것으로 기대된다.

세포 노쇠화(cell senescence)는 나이 듦에 따른 내인성 노화 및 질병들에서 나타날 수 있는 세포의 노화인자 발현, 세포분열 정지 등의 현상으로 일컬어진다. 피부세포의 경우, 노화 및 외부요인으로 인한 세포 노쇠화가 일어나 세포분열의 정지 및 기능 이상이 관찰되며 이는 피부노화를 가속화시키는 요인이 된다. 본 연구에서는, cordycepin을 이용하여 노화된 피부세포의 세포 노쇠화 억제 및 기능 향상을 유도하여 피부노화 개선의 가능성을 제시하였다. 사람에서 유래한 섬유아세포를 이용하여 세포의 β-galactosidase 활성 세포염색 결과, 많은 계대의 세포에서 발현이 높게 나타남을 알 수 있었다. 항산화 및 항염 효과가 알려진 cordycepin을 많은 계대의 세포에 처리하였을 때 β-galactosidase 활성이 확연히 떨어짐을 확인하였고 무혈청 배지 조건에서 많은 계대 세포의 증식 및 생존율을 높이는 결과를 보였으며 세포 노쇠화와 많은 연관성이 대두되고 있는 미토콘드리아의 기능관련 실험을 진행한 결과, 높은 ROS억제능이 나타났다. 본 연구를 통하여 노화된 사람 피부 섬유아세포에서의 cordycepin의 세포 노화 개선능을 알 수 있었으며, 피부 항노화소재로서의 가능성을 확인하였다.

본 연구는 돌연변이원(mutagen)의 하나인 메틸수은(methylmercuric chloride, MMC)의 세포독성을 알아보기 위하여 배양 NIH3T3 섬유모세포를 재료로 메틸수은의 독성을 산화적 손상측 면에서 조사하였으며, 또한 메틸수은의 세포독성에 대한 꿀풀 (Prunella vulgaris L. var lilacina Nakai) 추출물의 영향을 세포 생존율을 비롯한 SOD-유사 활성(SOD-like activity) 및 지질과산 화(lipid peroxidation, LP) 저해능과 같은 항산화 측면에서 분석 하였다. 본 실험에서 배양 NIH3T3 섬유모세포에 15∼35uM의 메 틸수은을 처리한 결과 처리농도에 비례하여 세포생존율이 대조군 에 비하여 유의하게 감소하였으며, 또한 XTT50값이 34.2uM에서 나타나 고독성(highly-toxic)인 것으로 나타났다. 한편, 항산화제 인 vitamin E는 메틸수은에 의하여 감소된 세포생존율을 유의하게 증가시켰다. 메틸수은의 세포독성에 대한 꿀풀 추출물의 영향에 있 어서, 꿀풀 추출물은 메틸수은에 의하여 감소된 세포생존율을 유의 하게 증가시킴으로서 메틸수은의 세포독성을 방어하였으며, 동시 에, SOD-유사 활성 및 지질과산화 저해능을 보임으로서 항산화능 을 나타냈다. 위의 결과로 부터 메틸수은의 세포독성에 산화적 손 상이 관여하고 있으며, 동시에 꿀풀 추출물은 항산화능에 의하여 메틸수은의 산화적 손상을 효과적으로 방어하였다. 따라서, 꿀풀 추출물과 같은 천연물질은 메틸수은과 같이 산화적 손상과 관련된 중금속의 독성을 방어 내지는 치료하는데 있어 항산화 소재로서의 유효한 기능이 있음을 제시하고 있다.

폐경 이후 여성에서 발생되는 에스트로겐의 감소는 피부노화와 밀접한 관련이 있으며, 피부의 정상적 상태와 기능을 저하시키게 된다. 지난 10여 년간 보고된 많은 연구결과를 살펴보면, 에스트로겐은 폐경 이후 여성의 피부에서 콜라겐 감소를 막아주고, 탄력을 회복시키며, 건조한 피부를 개선시키는 등의 피부 안티에이징 효능을 가지는 것을 알 수 있다. 에스트로겐과 유사한 구조로 인해 파이토에스트로겐이라 알려진 이소플라본은 자외선에 의해 유도된 피부 손상을 보호하는 기작이 널리 알려져 왔으나 피부세포에서 에스트로겐과 유사한 안티에이징 효능을 가지는지에 대해서는 많은 연구가 진행되지 않았다. 이에 본 연구에서는 콩류 등에 많이 함유된 이소플라본인 다이드제인이 에스트로겐과 유사한 활성 및 효능을 가지는지 밝히고자 하였다. 먼저 에스트로겐 수용체와의 결합을 통한 transcriptional activity에 미치는 효과를 luciferase assay를 통해 살펴본 결과, 다이드제인은 대조군에 비해 농도 의존적으로 estrogen receptor-dependent transcriptional activity를 유의하게 증가시켰다. 다음으로 사람의 피부 섬유아세포를 이용하여 다이드제인이 세포외 기질단백질 성분들의 발현에 미치는 효과를 조사한 결과, 다이드제인은 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 IV, 엘라스틴 및 피브릴린-1의 발현을 유의하게 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 모든 실험조건에서 에스트로겐 단독 효능과의 비교 분석을 통해 다이드제인은 에스트로겐과 유사한 효능을 가진다는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과를 통해 다이드제인은 기존에 알려진 이소플라본의 광보호 효능과 더불어 파이토에스트로겐 효능을 가짐으로써 갱년기 여성의 피부 안티에이징을 위해 활용할 수 있을 것이라 제안한다.

마디풀과(Polygonaceae)에 속하는 소리쟁이(Rumex crispus L.) 추출물이 환경오염원인 염화카드뮴(CdCl2)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 배양 NIH3T3 섬유모세포(NIH3T3 fibroblast)를 재료로, 이의 항산화(antioxidation) 및 멜라닌화(melanogenesis)에 대한 영향을 조사하였다. 본 연구에서 CdCl2는 배양 NIH3T3 섬유모세포에 처리한 농도에 비례하여 세포생존율을 유의하게 감소시켰으며(p<0.001), 이 과정에서 XTT50값은 45.7μM로 측정되었다. 또한, 이 값은 Borenfreund and Puerner에 의한 독성판정기준에 따라 고독성인 것으로 나타났다. 한편, 항산화제인 vitamin E는 CdCl2에 의하여 감소된 세포생존율을 유의하게 증가시킴으로서 CdCl2의 세포독성을 방어하였다. CdCl2의 세포독성에 대한 소리쟁이 추출물의 영향에 있어서는, 소리쟁이 추출물은 CdCl2만의 처리에 비하여 세포생존율을 유의하게 증가시켰으며(p<0.001), 또한 DPPH-라디칼 소거능(DPPH-radical scavenging activity)에 의한 항산화능을 나타냈다. 멜라닌화에 있어서, 소리쟁이 추출물은 CdCl2에 의하여 증가된 티로시나제(tyrosinase) 활성과 총멜라닌양을 모두 유의하게 감소시켰다(p<0.001). 이상의 결과로부터 CdCl2의 세포독성에 산화적 손상이 관여하고 있으며, 소리쟁이 추출물은 항산화능에 의하여 CdCl2의 세포독성을 효과적으로 방어하였다. 또한 소리쟁이 추출물은 티로시나제 활성과 총멜라닌양을 유의하게 감소시킴으로서 멜라닌화를 방어하는데 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 소리쟁이와 같은 천연물을 대상으로 CdCl2 처럼 산화적 손상과 관련된 중금속계 환경오염원의 독성으로부터 보호할 수 있는 물질에 대한 탐색 및 개발은 이의 활용적 가치가 크다고 생각된다.

피부 섬유아세포는 인간 피부의 주요 콜라겐 생산 세포이다. 노화가 진행되면, 섬유아세포에서의 콜라겐 생산이 감소되고, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)에 의해 시작되는 콜라겐 조각화가 증가된다. 즉 섬유아세포의 콜라겐 항상성의 불균형으로 인해 피부 collagenous, 세포외기질(ECM)의 구조와 기능이 변형되어,피부노화가 촉진되는 것이다. Cysteine rich protein 61 (CCN1)는 CCN family의 일부이며, 인간피부의 섬유아세포에서 콜라겐 항상성을 조절하는 단백질이다. 노화된 인간 피부 섬유아세포에서의 CCN1 과 발현은 실질적으로 유형 Ⅰ procollagen 생성을 감소시킴과 동시에 MMP-1의 발현을 증가시켜 섬유의 콜라겐 저하를 일으킨다. 그리고 노화된 섬유아세포는 노화 전 섬유아세포에 비해 증식률이 감소한다. 본 연구에서 만들어 사용한 복제 노화 피부 섬유아세포는 유형 Ⅰ procollagen의 생성량이 감소하였고, MMP-1의 발현 수준이 증가하는 특징을 나타냈다. 또한 CCN1 단백질의 발현이 증가되고, 증식률이 감소하는 특징을 나타냈다.가수분해 구멍갈파래 추출물은 노화 전 섬유아세포에서 새로운 콜라겐의 합성을 촉진하고 자외선에 의해 증가된 MP-1의 발현을 감소시켜 광노화를 개선하는 물질로 알려져 있다. 본 연구에서는 이러한 활성을 나타내는 가수분해 구멍갈파래 추출물을 사용하여, 복제 노화 피부 섬유아세포에서 가수분해 구멍갈파래 추출물에 의한 CN1 단백질의 발현 억제 여부를 조사하였으며, 이들 추출물은 배양된 복제 노화 피부 섬유아세포에서 유형 Ⅰprocollagen의 생성을 증가시켰으며, MMP-1 발현을 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, 콜라겐 항상성을 조절하는 단백질인 CN1 발현을 크게 감소시켰으며, 노화세포의 증식률을 증가시켰다. 이 결과는 복제 노화 섬유아세포가 in vitro 자연 노화모델로 화장품 원료 활성 연구에 사용될 수 있음을 말한다. 그리고 가수분해 구멍갈파래 추출물은 광노화 뿐 아니라 자연노화를 개선하는 피부미용제로 주름개선 기능성 화장품에 사용가능 하다는 것을 의미한다.