This study investigates the endoplasmic reticulum (ER) stress and subsequent apoptosis in duced during somatic cell nuclear transfer (SCNT) process of porcine SCNT embryos. Porcine SCNT and in vitro fertilization (IVF) embryos were sampled at 3 h and 20 h after SCNT or IVF and at the blastocyst stage for mRNA extraction. The x-box binding protein 1 (Xbp1) mRNA and the expressions of ER stress-associated genes were confirmed by RT-PCR or RT-qPCR. Apoptotic gene expression was analyzed by RT-PCR. Before commencing SCNT, somatic cells treated with tunicamycin (TM), an ER stress inducer, confirmed the splicing of Xbp1 mRNA and increased expressions of ER stress-associated genes. In all the embryonic stages, the SCNT embryos, when compared with the IVF embryos, showed slightly increased expression of spliced Xbp1 (Xbp1s) mRNA and significantly increased expression of ER stress-associated genes (p<0.05). In all stages, apoptotic gene expression was slightly higher in the SCNT embryos, but not significantly different from that of the IVF embryos except for the Bax/Bcl2L1 ratio in the 1-cell stage (p<0.05). The result of this study indicates that excessive ER stress can be induced by the SCNT process, which induce apoptosis of SCNT embryos.

This experiment was carried out to enhance plantlet conversion and ex vitro survival of encapsulated somatic embryos of Siberian ginseng. Cotyledonary somatic embryos were encapsulated with 3.0% sodium alginate and 96% of conversion rate in terms of plantlet with well-developed epicotyl marked when the encapsulated embryos were placed on perlite soils wetted with sucrose solution as for carbon source. However, post-germinative growth of encapsulated embryos was suppressed in case of sucrose did not added. Instead of sucrose alone, the addition of both sucrose and starch to the sodium alginate enhanced the post-germinative growth of the embryos. In sodium alginate matrix with 2% sucrose, the survival rate of the encapsulated embryos was more than twice (23.5%) that of ones without sucrose (10.0%). Embryos encapsulated with both 2% sucrose and 1% starch showed the highest percentage (42.1%) of survival rate was shown. In analysis of Iodine staining and starch content in the sodium alginate matrix, the starch component was decomposed when the embryos started to germinte. This result indicated that the carbohydrate treatments (starch and sucrose) in the encapsulation matrix enhanced the survival rate of post-germinative growth of encapsulated embryos in Siberian ginseng.

멜론으로부터 체세포배를 얻기 위하여 유식물체의 배축 절편을 1 mg/L 2,4-D와 0.5 mg/L BA가 혼합첨가된 MS배지 치상하여 6주 동안 배양하였다. 배축절편으로부터 연한 노란색의 부드러운 캘러스 형성을 거쳐 형성된 체세포배중에는 2개의 자엽을 갖는 정상적인 형태의 체세포배(26%)와 합생 자엽을 갖는 나팔형의 비 정상적인 체세포배(74%)가 관찰되었다. 정상 체세포배의 하배축 부위에서는 원형의 전형성층 조직이 발달되었고, 자엽 절 부위로 이동되면서 점차 독립적으로 나뉘어져 자엽에서는 완전히 2개의 전형성층 조직으로 분화하였다. 그러나 합생 자엽을 갖는 나팔형의 체세포배에서는 하배축에서 발달된 원형의 전형층조직이 자엽 절과 자엽부위에서도 원형의 전형성층 조직으로 연결되어 있었다. 또한 2개의 자엽을 갖는 정상 및 합생 자엽을 갖는 비 정상 체세포배 tunica-corpus구조를 볼 수 없었으며 전형적인 dome구조도 관찰할 수 없었다. 이러한 결과는 체세포배에서 전형성층 조직의 분화는 자엽형성 및 유경조직 형성과 밀접한 관계가 있는 것으로 추측할 수 있다.

Somatic embryos on growth regulator-free medium can be produced directly from cotyledon explants of Panax ginseng C. A. Meyer. When the embryo developmental stage was torpedo and cotyledon, the germination rate of embryos was quite high on MS medium supplemented with gibberellic acid (GA3). However, the percentage of plantlet formation at the cotyledon stage was higher than that at the torpedo stage. This result demonstrates that the embryo at the cotyledon stage was the most appropriate for increasing germination by GA3. Embryos cultured on medium including four levels of GA3 concentrations (3, 5, 10, or 20 mg/l) showed all quite high germination rates (87-91%). When the well-developed embryos were continuously cultured on media including high concentrations of GA3 from 10 to 20 mg/l, the percentage of formation of normal plantlets was lower than that seen under low concentrations from 3 to 5 mg/l. This treatment of high concentrations resulted in shoots with abnormal shape. The optimal GA3 treatment provides a basis for the efficient method obtaining healthy plantlets derived from ginseng somatic embryos.

Somatic embryos do not survive at exposure to liquid nitrogen temperatures without cryoprotective treatments. A simplified technique which simultaneously induces and cryoprotects embryogenic calli using plant vitrification solution 2 (PVS2) followed by dehydration was developed for the cryopreservation of Soap berry genetic resources. Vitrification is a way of removing the moisture in vegetation through PVS2. The PVS2 vitrification solution consisted of 30% glycerol (w/v), 15% ethylene glycol (w/v), 15% Dimethylsulfoxide (w/v) in B5 medium containing 0.4M sucrose. Two tests were done. The one was to eliminate moisture at 0℃ and the other at 25℃. In both cases the best results came out at a vitrification time of 10~20 minutes. It was also found that the survival rate was higher at 0℃ than at 25℃. In particular, the survival rate reached more than 80%. Water-damaged embryos turned brown and stoped growth, but energetic embryos took on a milky hue and show a very vigorous growth rate. Successful cryopreservation of somatic embryos of soapberry can be used to establish in vitro genebanks for long-term conservation of Soapberry genetic resources to complement field genebanks and other in vitro methods already being used.

체세포배발생을 이용한 가시오갈피 대량증식체계 확립을 위하여 저온처리에 의한 체세포배의 장기저장 실험을 수행하였다. 현탁배양 체세포배의 4℃에서의 저온저장에는 구형배 이전의 조기단계의 체세포배가 적합하였고 2 g/l 이하의 낮은 접종밀도에서는 36개월 이상 저장이 가능하였다. 장기간 저온 저장한 체세포배는 상온에 옮긴 후 2,4-D를 첨가한 배지에서만 성장을 회복하여 배발생캘러스를 형성하였으며 배발생캘러스의 증식속도는 배양온도를 32℃로 높였을 때에 가장 효율적이였다.

당근(Daucus carota L. cv. Hongshim)의 접합자배와 체세포배의 경정부의 구조는 주사전자현미경과 종단면 관찰을 통하여 이루어졌다. 접합자배의 경정부는 도립된 보우트형이고, 2ㆍ3ㆍ4자엽 체세포배의 경정부는 각각 도립된 보우트형, 피라미드형 및 볼록한 다이아몬드형으로 나타났다. 접합자배의 경정부는 다소 작은 세포들로 구성되어 있고, 초층과 내체의 구별이 된다. 체세포배의 경정부는 다소 큰 세포들이 불규칙하게 배열되어 있다.

본 실험(實驗)은 칼란코에 (Kalanchoe daigremontiana Hamet et Perr.)의 줄기 절편(切片)과 약(葯)을 배양(培養)하여 체세포배(體細胞胚)를 양도(諒導)함에 있어서 여러 식물생장조절물질(植物生長調節物質) 특히. 2,4-D의 효과(效果)를 비교(比較)하고자 실시하였던 바, 두 종류의 절편체에 실시하였던 바, 두 종류의 절편체에 있어서 캘리스 및 체세포배의 유도에 있어 2.4-D는 효과가 없었다. 줄기 절편(切片)으로부터 캘러스의 유도(誘導)는 2,4-D에 비해 IAA와 NAA 첨가(添加)의 경과(境過)에 양호하였으며, 체세포배(體細胞胚)의 유도(誘導)는 배발생(胚發生) 캘러스를 0.1mg/L 1AA와 1.0mg/L BAP 처리구(處理區)인 저농도(低濃度)의 auxin 처리구(處理區)와 식물생장조절물질(植物生長調節物質)이 첨가(添加)되지 않은 배지에 이식(移植)하여 배양(培養)과 경과(境過)에 양호(良好)하였으나. 2,4-D의 처리구(處理區) (0.2-1.0mg/L)에 이식(利殖)하여 배양한 경우에는 일어나지 않았다. 또한, 약(葯)으로부터 캘러스의 유도(誘導)는, 발달단계별(發達段階別)로는 초기 1핵기에서 그리고, 저온(低溫) 처리는 4℃에서 3일간 전처리(前處理)한 경우(境遇)에 양호(良好)하였고, 2.4-D에 비해 NAA 처리시(處理時)에 양호(良好)하였으며, 그리고 charcoal 처리시(處理時)엔 전혀 일어나지 않았다. 한편 체세포배(體細胞胚)의 유도(誘導)는 줄기절편에서와 같이 2,4-D처리시에는 일어나지 않았으나, 줄기절편의 경우와는 달리 1.0mg/L NAA와 1.0mg/L BAP 처리구와 2.0mg/L NAA와 0.2mg/L BAP 처리구(處理區)인 고농도(高濃度)의 auxin 처리구(處理區)에서 양호(良好)하여, 줄기 절편과 약에 있어서 생장조절물질(生長調節物質)에 대한 반응에 차이(差異)가 다소 있음을 알 수 있었다. 약유래 식물체의 염색체(染色體)조사결과 대부분이 2n=34이었으며, 소수(小數) (5.4%)가 4배체이었다.

현탁배양으로 체세포배를 대량 생산하는데 관여하는 요인 들을 조사분석하고. 생산된 체세포배를 encapsulation시켜 인공종자화가 가능한지를 검토한 결과를 요약하면 아래와 같다. 1. 현탁배양에서 LS(Linsmeier-Skoog) 배지가 어뢰형과 자엽기의 체세포배 형성율이 높았다. 2. 현탁배양시 체세포배 형성에 영향하는 탄소원은 sucrose가 가장 효과적이었다. Gtucose에서도 자엽 기의 체세포배가 형성되었으나 sucrose에서보다는 적었다. Fructose, lactose 및 maltose는 효과가 없었다. 3. 현탁 LS 배지에서 sucrose 농도는 3%가 체세포배 형성에 적합한 농도로 나타났다. 4. 현탁 LS 배지에서 질소원을 달리하여 체세포배 형성율을 조사한 결과 암모니아태 질소의 영향은 거의 없는 것으로 나타났다. 또한 암모니아태 질소와 질산태 질소의 비율을 413(mg/l) : 1900(mg/l)로 하는 것이 바람직하다고 판단되었다. 5. 현탁배양에서 계대배양 3회까지는 체세포배형성에 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 불필요하게 계대배양 회수를 증가시킬 필요는 없다고 본다. 6. 고형배지에서 체세포배 형성을과 형성 수에는 BA단독보다는 NAA를 혼용하는 것이 효과적이었으며 이 효과는 BA 농도가 높은 경우에 크게 나타났다. 7. 고형배지에서 체세포배 형성율과 형성 수에는 kinetin 단독보다는 NAA와 혼용하는 것이 바람직하며 이 효과는 kinetin의 농도가 높은 경우가 좋았다. 8. 고형배지에서 체세포배 형성율과 형성 수에는polyamines 중에서 spermidine과 spermine이 효과적이었으며 spermine 10mg/l처리에서 가장 많은 체세포배가 형성되었다. 9. 기내묘에서 발생하는 vitrification을 억제시키기 위하여 질산은을 처리하더라도 체세포배 형성이나 형성율에 별다른 영향이 없었다. 10. 체세포배를 encapsulation 할 때 인공종자의 구형 형성은 sodium alginate 농도를 3%로 인한 경우 가장 좋았으나 인공종자의 발아율은 2.5%에서 100% 발아가 되었고 3%에서는 88%가 발아하였다. 11. 인공종자는 발아하여 정상적으로 생장하면서 shoot와 root를 형성하였다.

체세포배의 생산, 보호 및 저장조건의 구명과 체세포배의 기내분화 및 체세포배 배양식물의 유전변이 여부를 탐색하기 위한 연구를 수행한 결과 MS기본배지 보다 1/2MS배지가 체세포배형성에 가장 효과적이었으며 BA, kinetin처리 모두 0.1~1mg/L에서 체세포배가 발이하여 식물체 형성이 양호하였고 농도가 높을수록 억제되는 경향을 보였으며 shoot의 발근과 신장을 위해서는 IAA처리가 효과적이었다. 1/2MS기본배지에 2.0%의 알진산 용액으로 알진산캡슐을 씌운 체세포배의 기내에서의 식물체형성(전환율)은 AgNO35mg/l처리가 86%로 가장 앙호하였다 . 5℃에서 3개월 동안 체세포배를 저온저장하여 65%의 발아가 이루어졌으며 저장기간이 길어질수록 발아율이 저하되었다. 체세포배 배앙식물은 RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA)분석을 통하여 여러 major band 수준에서 DNA polymorphism이 관찰되었다.