Bacillus thuringiensis는 포자형성기 동안에 위생해충이나 농업해충에 독성을 보이는 내독소 단백질을 생성한다. 내독소 단백질의 모기 유충 방제효과를 높이기 위해, 광합성에 관여하는 psbA promoter로 모기 살충성 cry11Aa유전자를 발현하는 pSyn4D벡터를 제작하고, 모기 유충이 먹이로 이용하는 Synechocystis PCC6803에 형질 전환시켰다. 형질 전환체들은 kanamycin이 포함된 배지에서 선발되었으며, 정상적인 생물검정을 통해 형질 전환체 Tr2C를 선발하였다. cry11Aa 유전자는 형질전환체의 genomic DNA에 안정적으로 결합되어 있는 것을 PCR을 이용하여 확인하였다. 형질전환체 Tr2C는 약 72-kDa크기의 Cry11Aa 단백질을 발현하였으며, 작은빨간집모기(Culex tritaeniorhynchus) 3령 유충과 중국얼룩날개모기(Anopheles sinensis) 3령 유충에 75%가 넘는 살충력을 보였다. 모기 유충에 대한 형질전환체의 반수치사시간(LT)은 작은빨간집모기 유충과 중국얼룩날개모기 유충에 대해 각각 2.1일과 0.7일이었다. 이상의 결과들은 형질전환체 Tr2C가 모기 유충방제에 유용하게 이용될 수 있음을 보여준다.

본 연구는 생체 내 세포 및 조직배양기로서의 면역결핍동물을 개발할 목적으로 proximal lck promoter와 DT-A gene를 이용하여 형질전환생쥐을 생산하고 이 형질전환생쥐의 면역세포에서 DT-A gene이 발현되는지를 분석하였다. 형질전환생쥐와 정상생쥐로부터 thymus, spleen 및 liver에서 RNA를 추출하여 RT-PCR수행하였는데 정상생쥐의 조직에서는 어떠한 DT-A gene의 발현양상을 얻을 수 없었으나 형질전환생쥐의 thymus, spleen, liver에 DT gene의 발현을 확인할 수 있었고, Northern blotting을 이용하여 형질전환생쥐의 thymus, spleen 및 liver에서 DT-A gene이 강하게 발현되는 것으로 나타났다. 형질전환생쥐 F₁ 및 F₂ 산자의 혈액에서 T-cell 발달의 분포도를 확인하기 위해 CD4 및 CD8 ntibody를 이용하여 FACS analysis를 실시하였는데 형질전환생쥐의 혈액 내 mature T-cell인 single positive thymocyte의 수가 정상생쥐에 비해 감소하는 경향을 나타냈다. 정상생쥐의 혈액 내 T-cell 중 CD8/sup +/ T-cell의 경우 약 50%를 나타냈으나 형질전환생쥐의 경우 33%로 감소하였고, CD4/sup +/ T-cell은 정상생쥐에서 10%를 차지하고 있으나 형질전환생쥐에서는 5.9%로 감소되는 것으로 분석되었다. 그러므로 본 연구의 형질전환생쥐에서 lck promoter에 의해 초기 immature한 상태의 T-cell에서 DT-A gene이 발현되어 발육중인 T-cell이 파괴 되어 mature 상태인 CD4/sup +/ CD8/sup -/나 CD4/sup -/CD8/sup +/ cells (single-positive)들이 감소된 것으로 확인되었다.

hFSH는 α와 β subunit으로 구성된 heterodimer로서 두 subunit의 조합은 활성을 지닌 호르몬의 생산에 있어서 매우 중요한 단계이다. 이 조합과정의 효율을 증대하기 위하여 본 연구에서는 hFSH를 단일사슬의 단백질로 구축하고자 하였으며, 이의 일환으로 각 subunit 대한 cDNA단편을 연결하는 서열로 CTP linker를 도입하였다. 재조합한 hFSH-CTP 유전자는 pseudotype의 retrovirus vector system을 이용하여 CHO 세포와 닭의 배로 각각 전이되었다. CHO 세포에서의 FSH의 생산은 α와 β를 각각 전이한 경우에 비해 hFSH-CTP를 전이한 경우에서 17배 이상 높은 것으로 나타났다. 닭에서는 유전자 전이를 시도한 62개체 중에서 11마리가 부화하였으며 그 중 10마리가 형질전환된 닭인 것으로 RT-PCR을 통하여 확인되었다. 그러나 개체의 혈중 FSH의 생산은 확인하지 못하였다. 이상의 실험 결과를 바탕으로 하여 재조합된 hFSH-CTP는 FSH의 발현에 매우 효율적인 구조로 생각되며, 또한 retrovirus를 이용한 유전자 전이 방법은 형질전환 가금의 생산에 있어서 매우 적절한 방법으로 사료된다.

본 연구는 생체 내 세포 및 조직배양기로서의 면역결핍동물을 개발할 목적으로 proximal Ick promoter와 DT-A유전자를 이용하여 형질전환생쥐를 생산하였고 형질전환생쥐의 면역기관에서 Di-phteria toxin이 발현되어 T-cell이 결핍되는지를 분석하였다. 총 암수 2마리의 형질전환생쥐를 PCR과 South-ern blotting으로 분석하여 얻었으며 이식유전자의 copy수는 약 2∼3 copy가 정착된 것으로 확인되었다. 형질전환생쥐의 thymus, spleen, liver 조직을 분리한 후 total RNA를 추출하여 poly(dT) primer 와 DT 특이적 primer를 이용하여 RT-PCR수행 결과 형질전환생쥐의 thymus, spleen, liver에서 DT gene이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 형질전환생쥐의 이들 조직간에 DT 발현량에는 큰차이는 없는 것으로 확인되었다. 형질전환생쥐의 혈액에서 적혈구, 백혈구 ,혈소판, 헤모글로빈 등이 정상생쥐보다 감소되었고 특히 백혈구수와 혈소판의 수가 크게 감소되어 있는 것으로 나타났다. 또한 형질전환생쥐의 혈액을 CD3 antibody를 이용하여 FACS 분석을 실시하여 형질전환생쥐의 혈액 중 T-cell이 수가 비정상적으로 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 Ick-DT 형질전환생쥐에서 DT유전자의 발현에 의한 T-cell 결핍을 유도할 수 있는 것으로 나타나 이를 바탕으로 돼지를 이용한 사람의 이종장기 배양용 형질전환동물을 생산하여 응용될 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구의 목적은 inbred 마우스 (C57BL/6J)의 수정란을 이용하여 형질전환마우스를 생산할 때, 수정란이식의 효율성을 증진시키기 위한 것이다. C57BL/6J 및 BCF1 마우스로부터 과배란처리 방법에 의해 수정란을 얻고, DNA를 1 세포기 수정란에 미세 주입한 다음, 1세포기 또는 2 세포기의 수정란을 가임신된 마우스의 한쪽 또는 양쪽 난관에 각각 이식하였다. 1세포기의 수정란을 0.75 d.p.c. 가임신된 마우스의 한쪽 난관에 이식했을 때, 임신율이 C57BL/6J는 68.8±7.83%, BCF1은 48.3±14.22% 이었고, 이식한 수정란 당 산자의 발달율은 C57BL/6J가 11.9±5.51%, BCF1은 10.5±8.03%로 성적이 저조하였다. 그러나, 2세포기의 수정란을 0.5 d.p.c. 가임신된 마우스의 양쪽 난관에 이식했을 때, 임신율이 C57BL/6J는 94.4±9.64%, 13CFl은 100±0% 이었고, 이식한 수정란 당 산자의 발달율은 C57BL/6J가 22.1 ±0.4%, BCF1은 21.8±0.38%였다. 따라서 C57BL/6J 마우스의 2세포기 수정란을 0.5 d.p.c. 가임신된 마우스의 양쪽 난관에 이식하는 것이, BCF1마우스와 유사한 성적을 얻어 경쟁력이 있는 것으로 판단되었다. 이러한 결과에 영향을 미치는 인자가 여러 가지 있을 것으로 판단되지만, C57BL/6J 마우스의 2세포기 수정란을 0.5 d.p.c.가임신된 마우스의 양쪽 난관에 이식하는 방법이 다른 방법보다 형질전환마우스를 생산하는데 효율성이 더 높은 것으로 본 실험에서 확인되었다.

인체 트롬보포이에틴(hTPO)은 megakaryopoiesis 과정에 주요한 역할을 하는 사이토카인이다. 따라서 이러한 트롬보포이에틴을 유선조직에서 직접적으로 발현시키기 위하여 소 베타 카제인 프로모터, 인체 트롬보포이에틴 cDNA 및 네오유전자로 구성된 발현벡터를 구축하였다. 소 귀조직 세포로부터 유도된 섬유아세포에 lipoffctamine을 이용하여 발현벡터(pBT-L n대)의 삽입을 유도하였다. G4l8 저항성을 지닌 세포의 콜로니 형성을 유도하기 위하여 2주 이상 배양을 실시하였다. 형질전환 콜로니는 PCR에 의해 동정하였으며, 이들 콜로니를 핵치환 전까지 계속적으로 증식을 유도하였다. 형질전환 세포에 의해 재구성된 난자는 전기적인 융합과 calcium ionophore와 6-DMAP를 이용한 활성화를 실시하였으며, 체외에서 7일간 배양을 실시하였다. 총 35개의 콜로니를 PCR에 의해 분석한 결과, 이 중 29(82.9%)개가 형질전환된 콜로니였다. 형질전환된 세포로 재구성된 난자의 난할율 및 배반포로의 발달율은 65.1%와 23.8%로 나타났다. 형질전환된 세포로 재구성된 난자로부터 발달한 29개의 배반포 중 27개가 형질전환으로 확인되었다. 따라서 이러한 결과들은 형질전환 소 수정란을 형질전환된 세포를 이용한 체세포 복제 기법을 통해 효과적으로 생산할 수 있다는 것을 제시하고있다.

형질전환 동물의 유선에서 특이적으로 인간 TPO가 발현되도록 고안된 pBT-L 외래유전자가 삽입되어 한 계통으로 확립된 형질전환 생쥐에서 이 유전자가 장기 세대까지 안정적으로 전이되고, 또한 발현 수준도 지속적으로 유지되는지를 조사 하였다 이를 위해 제 5세대의 수컷 pBT-L 형질전환 생쥐를 실험에 공시하였고, 제 10세대까지의 전이율과 인간 TPO의 발현수준을 분석하였다. 제 8세대 생쥐의 계대 번식에 의한 자손 중 51.3±18.98%가 형질전환 생쥐로 판명되었다. 또한 제9세대에서 외래 유전자의 전이율은 43.8±18.98%이었고, 제 10세대에서는 71.4±26.98%의 전이율을 나타내었다. 이러한 결과로 pBT-L 형질전환 생쥐는 그 외래유전자의 유전적 손상이 없이 장기 세대까지 안정적으로 전이되는 것으로 판단된다. 제 9세대외 10세대의 3마리의 암컷 형질전환 생쥐로 부터 유즙내 인간 TPO의 발현 수준을 분석하였을때, 그 농도는 모두 평균 1.1 mg/ml의 수준에서 측정되었다. 이러한 수준은 제 2세대의 것과 유사한 결과로 pBT-L 형질전환 생쥐에서 인간 TPO 유전자의 발현은 최소한 10세대까지 지속적으로 유지된다는 것을 알 수 있었고, 더 긴 장기 세대까지도 발현 수준이 유지될 것으로 추정된다. 이러한 연구결과는 계통으로 확립된 형질전환동물에 부여된 새로운 유전형질은 장기 세대까지 유전될 수 있음을 보여주는 것이다.

MT-GHR(Growth hormone receptor)와 MT-IGF-IR(IGF-1 receptor)유전자를 구축하고 micromani-pulator를 이용하여 토끼 수정란에 유전자를 주입하여 형질전환토끼를 생산하였다. 본 연구에서의 형질전환토끼의 생산효율은 약 3%를 나타내었고 Growth Hormone receptor(GHR)를 가진 형질전환 토끼와 IGF-1 receptor(IGF-lR)를 가진 형질전환토끼를 10마리 이상씩 생산하였다. 또한 정상 토끼와 교배시켜 F₁ 새끼를 얻어 유전자가 다음세대에도 전달되는 것을 확인하였다. GHR 이나 IGF-1R 형질전환토끼의 성장률은 정상토끼보다는 약15∼25% 정도 빠른 경향을 나타냈고 특히 GHR 형질전환토끼의 성장률이 더 높은 것으로 드러나 GHR 및 IGF-lR유전자가 형질전환토끼에서 성장에 영향을 주었다는 것을 확인할 수 있었다.

조류는 발생학적 특성상 수정과 초기 배발생을 제외한 거의 대부분의 개체발생 과정이 난각 속에서 진행된다. 그러므로 수정란에 생명 공학적 기법을 적용하는데 있어서, 포유류의 경우 여러 생명공학 기법이 적용된 수정란은 초기발생을 위한 체외배양 이후 반드시 모체에 이식되어야 하지만, 조류의 경우 인공적인 체외배양 체계가 확립되어 있어야 생명공학 기법이 적용된 수정란을 개체까지 발생시킬 수 있게 된다. 닭의 난자는 난관 누두부에 배란 후 약 15분내에 정자의 침입을 받아 수정되어 난관 팽대부에 도달하면 1세포기 수정란이 된다. 그 후 수정란이 협부에 도달하면 최초로 분할이 일어나기 시작하여, 방란시에는 그 세포수가 60,000개에 이르게 된다. 한편, 계란의 형성 과정에서는 다량의 난황을 포함한 난자가 난관 누두부로 배란되어 정자와 만나게 되면 수정란으로서 계란 형성이 계속되고 정자와 만나지 못하게 되면 무정란으로서 계란 형성을 계속하게된다. 배란된 난자가 난관누두부를 거쳐 난관팽대부에 도달되면 난자는 농후난백에 의해 둘러싸이게 되고 난관혈부에 도달되면 난각막이 형성되고 수양성 난백이 침적하게 된다. 그 후, 난관협부를 지난 난자는 난관자궁부에 도달되면 20시간이상 그곳에 머물면서 난각형성이 진행된 다음 방란된다. 따라서 수정란에 외래유전자를 미세주입하여 형질전환 닭을 생산하기 위해서는 수정란을 암탉의 난관 내에서 최초 분할되기 전에 외부로 끄집어내어야 하며, 수정란에 외래 유전자를 미세주입한 다음에는 다시 암탉의 난관내로 이식해야 하지만 현재까지 그러한 기술은 확립되어 있지 못하다. 그렇기 때문에 모체의 난관 속에서 일어나는 배 발생과 그 이후 개체까지의 발생을 위하여 인공적인 체외배양 체계가 확립되어 있어야 한다. 따라서 본 발표에서는 형질전환 닭을 생산하기 위한 양질의 1세포기 수정란 획득 방법과 획득된 수정란의 체외 배양방법에 관하여 기술적인 측면에서 고찰 해보고자 하며, 그와 같은 배양 기술을 이용하여 외래유전자를 도입한 일련의 결과에 관하여 보고 하고자한다.