본 연구는 배양 각막 상피세포에 anti - F AS and anti - F AS ligand antibody를 노출시 킨 후 세포고사 메커니즘을 결정하기 위해 시행하였다. 배양각막 상피세포에 antihuman FAS(N-18) goat polyclonal IgG를 50, 200, 500, 1,000 ng/m~ 또는 anti-human FAS ligand(C• 20) goat polyclonal IgG를 500 ng/m~으로 2 일과 4 일 동안 처 리 하였다. 주어진 기간 동안 배양한 후 배양액에 부유한 세포와 부착된 세포를 원심분리와 트립 신 처리 원섬분리를 이용하여 수확하였다. 각막상피세포에 대한 anti - F AS and antiF AS ligand antibody 의 영향을 알아보기 위해 Hoechst 33342 staining과 TUNEL stammg 방법을 이용하여 세포 세포고사 유도를 확인하였다. 세포막 수용체인 FAS protein의 발현을 알아보기 위해 ìmmunocytochemistry 를 시행하였다. anti-FAS antìbody를 처리한 군에서는 대조군에 비해 시간과 농도에 비례하여 후기 세포고사 소 견이 증가하였다. 그러나 anti - F AS ligand antibody를 처리한 군에서는 대조군과 차이 가 거의 없었다. 본 연구의 결과 FAS-FAS ligand system 이 각막상피세포에 발현되었 으며 이는 정상 각막 상피 생리 즉， 세포 탈피에 중요한 기능을 갖는 것으로 사료된다

콘택트렌즈 소독제로 쓰이는 H2Û2올 중화용 백긁 판올 이용하여 수회 반복 중화한 용액이 배양 각막상피세포의 Apoptosis룰 유도하는지 여부룹 조사하기 위해 본 연구 를 시행하였다 3% H202(AOSept)를 6시간 동안 9회에 걸쳐 통일 백금 판으로 풍화 한 용액을 배양 각막 상피세포에 배양액의 25% 농도로 1--2 띤 동안 처리하여 처음 중화한 용액과 9번째 중화한 용액음 중심으로 세포독성과 Apoptosis를 조사하였다. 세포똑성은 MTT assay를 이용하였으며 lnverted pþase-contrast microscope로 형 태 를 확얀하고 Toluiclin blue 염 색으로 Apoptotic Cell올 확언하였으며 Hoechst 33342 로 형광 염색하여 Apoptotic Index를 조사하였다. 또한 Annexin V - FITC깨ropiclium Iodide(PDstaíning, DePsipher TM assay. M30 CytoDEATH. TUNEL (TdT-dUTP terminal nick-end labelling) assay를 통해 형태적인 변화될 확인하였다. 생화학적 변 화인 DNA Fragmentation은 Agarose gel electrophoresis룹 사 행하였으며 Fas Antigen 의 발현을 조사하기 위하여‘ Irnmunocytochemistry와 Westem blotting올 시 행하 였다. H20z의 독성올 약화시키기 위해 사용되는 백금 판을 수회 재사용하여 중화한 용액닫 25% 농도로 1-2 일간 처리하였을 때 각막 상피세포의 Apoptosis가 유도되는 것 이 형 광 염 색， DNA ladder. Irnmunocytochemistry. Westem blotting등의 방법 으로 확인되었다. 따라서 중화된 H써2룹 25% 농도로 1-2 일 동안 처리한 결과， 세포 증식 저해와 Apoptosis 가 유도되므로 중화용 백금 판의 이용 횟수활 세한하거나 중화시간 을 증가시킬 필요가 있는 것으로 사료된다. 또한 완전하게 중화된 소독용 H202는 더 이상 소독효파가 없으므로 장시간 동안 렌즈의 소쪽보관 용액으로 사용해서는 안 된 다는 교육이 반드시 펼요할 것으로 판단된다.

One-step System으로 6시간 동안 중화된 H202의 배양 각막상피 세포에 대한 세 포독성과 Apoptosis를 조사하기 위해 세포에 15분간 직접 처리하여 세포의 형태적 변화， 생화화적 변화 그리고 면역화학적 발현 여부 등올 확인하였다. 세포독성은 형 태적 변화와 MTT Assay률 시행하였고 Apoptosis는 Hoechst 잃342의 형광염색으로 산 정 한 Apoptotic index, DePsipher™ assay를 이 용한 mitochondria 활성 과 변화를 확인하였으며 immunocytochemistry로 각막 상피세포 막의 수용체인 FAS 의 발현 여 부도 조사하였다. 중화된 H202를 15분간 처리 후 세포독성을 조사한 결과， 같은 디스크로 중화를 반 복한 경우 독성이 높게 나타났으며 세포증식도 느리게 나타났다.24시간 동안 세포를 정상 배양액으로 환원시켜 조사한 결과， 세포 독성에서 회복효과가 거의 없고 Apoptotic index도 높게 나타났다. 또한 미토콘드리아 활성과 초기 Apoptosis 에 대 한 검증도 모두 양성으로 나타났다. 그리고 Apoptosis 유도의 가장 중요한 경로인 FAS-FAS ligand system에 대 한 조사에 서 중화된 H20z를 처 리 한 세 포의 FAS 가 정 싱세포에서 보다 강하게 발현되는 것을 immunocytochemistry로 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 강력한 apoptosis 유도 물질인 H202를 콘태트렌즈 소독을 위해 One-step system으로 중화한 경우에도 불완전하게 중화된 Hz02에 의해 각막상피세 포의 Apoptosis가 유도되 므로 중화용 백금 디 스크의 반복된 사용올 금지 하거 나 반복 사용 시에는 시간을 더 늘려야 할 것으로 사료된다.

HCE 세포와 L929 세포를 배양하여 현재 시중에서 유통되고 있는 6 개 회사의 Lens Mate. ReNu. ReNu MultiPlus. SoLo Care Soft. Complete, Hypa Opia 등 7종 류의 MPS 를 배양세포에 처리하고 48 시간 동안 배양한 후 MTT 와 SRB 염색방법을 사용하여 세포 수준의 독성을 검정히였다. HCE세포와 L929세포에 MPS 를 처리하여 MTT assay 결과 4종-류의 MPS에서 세포 증식 저해율이 30% 이상으로 나타났고. 3 종류의 MPS는 대조군과 유사하거나 더 높은 증식율을 보였다. SRB assay 결과 HCE 세포에서는 5종류의 MPS 에서 세포 증식 저해율이 30% 이상으로 나타났다. 그 러나 L929 세포에서는 모든 제품이 세포 -증식 저해율 30% 이하로 나타났다. MPS를 세포주에 처리할 경우 MTT 방법이 SRB 방법보다 더 민감하였다. 이러한 결과로 볼 때 일부 제품의 MPS 가 HCE 세포와 L929세포 증식을 저해하는 것으로 사료된다.