Municipal landfill leachate (MLL) contamination in surface water is a critical global issue due to the high concentration of toxic organics and recalcitrants. The biological treatment of MLL is ineffective due to an elevated concentration of ammoniacal nitrogen, which restricts the production of the recalcitrant degrading laccase enzyme. In this context, integrating an external laccase-anchored carbon catalyst (LACC) matrix system with the microbial system could be an efficient strategy to overcome the drawbacks of conventional biological MLL treatment technologies. In the present study, the LACC matrix was synthesized by utilizing nanoporous activated carbon (NAC) functionalized ethylene diamine (EDA) and glutaraldehyde (GA) (GA/EDA/NAC) matrix for the anchoring of laccase. The maximum anchoring capacity of laccase onto GA/EDA/ NAC was achieved to be 139.65 U/g GA/EDA/NAC at the optimized anchoring time, 60 min; pH, 5; temperature, 30 °C, and mass of GA/EDA/NAC, 300 mg and was confirmed by Fourier transform Infrared Spectroscopy (FT-IR), Scanning Electron Microscope (SEM), and X-ray Diffraction (XRD) analyses. Further, the mechanistic study revealed the involvement of covalent bonding in the anchoring of laccase onto the functionalized surface of the GA/EDA/NAC matrix. The adsorption isotherm and kinetics of laccase anchoring onto the GA/EDA/NAC matrix were performed to evaluate its field-level application. Subsequently, the sequential microbial system (I-stage bacterial treatment followed by II-stage fungal treatment) and III-stage LACC matrix system could effectively reduce the COD by 94.2% and phenol by 92.36%. Furthermore, the Gas Chromatography-Mass Spectrophotometry (GC–MS) and FT-IR analyses confirmed the effective degradation of organic compounds and recalcitrants by the integrated microbial and LACC matrix system. The study suggested that the application of the LACC matrix system has resulted in the complete treatment of real-time MLL by overcoming the negative interference of elevated ammoniacal nitrogen concentration. Thus, the integrated microbial and LACC matrix approach could be considered to effectively treat the MLL without any secondary pollution generation.

In this study, we aimed to compare the mycelial growth of Pleurotus ostreatus after medium supplementation with various amino acids at different concentrations to select the optimal medium nutrient composition for mycelial growth. The mycelial growth of P. ostreatus was investigated after adding four amino acids (tryptophan, threonine, methionine, and lysine) at 0.5% or 1% to the medium.The rate of P. ostreatus mycelial growthwas faster in the potato dextrose agar (PDA) medium supplemented with threonine at 0.5% or 1% than that of the control, whereas it was inhibited by tryptophan treatment. Supplementation of sawdust mediumwith all amino acids, except tryptophan, at 0.5% did not alter the mycelial growth, compared to the controls. However, addition of any amino acid to sawdust medium at a higher concentration (1%) inhibited the mycelial growth. The laccase acitivity of P. ostreatus mycelium cultured in PDA medium was the highest when threonine was added, and the lowest when tryptophane was added, consistent with the results of the mycelial growth. Therefore, the addition of threonine, methionine, or lysine to PDA medium at a concentration of 0.5-1%was effective for increasing the mycelial growth of P. ostreatus; however, it inhibited mycelial growth insawdust medium, suggesting that the effects of amino acids dependedon the medium nutrient composition.

본 연구에서는 Flammulina velutipes var. lupinicola의 laccase 유전자를 동정하고 최적 활성 pH, 온도, 시간을 분석하고 하였다. F. velutipes var. lupinicola 유전체에서 선별된 laccase 유전자 서열을 바탕으로 구리 결합 부위 및 신호 펩타이드 분석을 수행한 결과 5종의 laccase 유전자(g1934, g1937, g2415, g2539, g5858)를 동정하였다. 5종의 선별된 laccase 유전자 크기는 1,488~1,662 bp로 확인되었고, cDNA 염기서열 분석 결과 14~17개의 인트론이 확인되었다. Laccase 유전자의 신호펩타이드로 예측된 절단 부위는 N-말단으로부터 20~34 bp 사이에 위치하는 것으로 확인되었다. F. velutipes var. lupinicola laccase의 활성 특성을 규명하기 위해 분리 정제를 수행하였으며, Zymogram을 수행하여 0.2 M 및 0.3 M NaCl과 1.6 M 및 1.7 M의 ammonium sulfate로 정제된 단백질에서 5개의 laccsae 활성 밴드를 확인하였다. pH, 온도 및 시간별로 분리 정제된 단백질의 최적 활성을 분석한 결과, 반응의 최적 pH는 5.5이고 최적 온도는 40 ̊C로 확인되었다. 따라서 본 연구를 통하여 확인된 F. velutipes var. lupinicola 유전체의 laccase 유전자 구조 및 활성에 대한 특성은 laccase를 이해하는 데 도움이 될 것이며 추가 연구를 통하여 향후 다양한 산업적 활용이 가능할 것으로 사료된다.

최근 Flammulina 종들에 대한 유전체 염기서열 분석 결과가 보고되었고, 그로 인해 다양한 유전자 정보가 밝혀지고 있다. 본 연구에서는 Flammulina elastica 전체 유전체 서열의 laccase 유전자를 동정하고 구조적 특징 분석을 수행하고자 하였다. 유전체 분석 및 생물정보분석을 통하여 F. elastica 유전체 내 3개의 laccase 유전자(Felac1, Fe-lac2, Fe-lac3)를 확인하였고, 이들 유전자 내에는 10개의 히스티딘 잔기와 1개의 시스테인 잔기를 가지는 구리 이온 결합 영역과 4개의 시스테인 잔기를 가지는 이황화결합 형성 부위가 존재하는 것을 확인하였다. 1,548~1,602 bp의 laccase 유전자에 대한 전장 cDNA 염기 서열 분석을 통하여 12~16개의 인트론이 존재하는 것을 확인되었으며, N-말단으로부터 17~22 bp의 사이에 신호 펩타이드가 존재하는 것이 확인되었다. 본 연구를 통하여 F. elastica의 laccase 유전자를 최초로 동정하여 구조적 특징을 분석하였고, 이러한 결과는 F. elastica의 바이오매스 분해에 대한 이해를 돕는데 활용될 것으로 사료된다.

가시오가피의 첨가는 영지버섯 균사체를 이용한 분비 단백질 라카아제 및 셀룰라아제의 생산량을 효율적으로 증가시켰다. 영지버섯 균사체의 생장률 측정에서 가시오가피의 첨가는 영지버섯 균사의 생장률이 톱밥에 비해 절반 수준에 밖에 못미치는 결과를 나타내었다. 반면에 영지버섯 균사의 분비 단백질인 라카아제와 셀룰라아제의 양을 증가시키는데 톱밥에 비해 큰 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 가시오가피가 첨가된 배양액에서의 라카아제 활성은 톱밥이 첨가된 배양액에서보다 영지 1호, 영지 2호 및 녹각 영지에서 0.61~2.37배 증가하였고, 이 중에서도 영지 2호는 0.947 U/min으로 라카아제 활성이 가장 높게 평가되었다. 셀룰라아제 활성 평가에서는 가시오가피가 첨가된 배양액에서의 셀룰라아제 활성은 톱밥이 첨가된 배양액에서보다 영지 1호, 영지 2호 및 녹각 영지에서 1.77~2.81배 증가하였고, 이 중에서도 영지 1호 및 영지 2호에 비해 녹각 영지에서 0.172 U/min으로 셀룰라아제 활성이 가장 높게 평가되었다. 따라서 가시오가피의 첨가가 영지버섯 균사의 분비 단백질 생산을 증가시키는데 유용한 소재로 사료된다.

The aim of this study was to identify and characterize new Flammulina velutipes laccases from its whole-genome sequence. Of the 15 putative laccase genes detected in the F. velutipes genome, four new laccase genes (fvLac-1, fvLac-2, fvLac3, and fvLac-4) were found to contain four complete copper-binding regions (ten histidine residues and one cysteine residue) and four cysteine residues involved in forming disulfide bridges. fvLac-1, fvLac-2, fvLac3, and fvLac-4, encoding proteins consisting of 516, 518, 515, and 533 amino acid residues, respectively. Potential N-glycosylationsites(Asn-Xaa-Ser/Thr) were identified in the cDNA sequence of fvLac-1(Asn-454), fvLac-2(Asn- 437andAsn-455), fvLac-3(Asn-111andAsn-237), and fvLac4 (Asn-402andAsn-457). In addition, the first 19–20 amino acid residues of these proteins were predicted to comprise signal peptides. Laccase activity assays and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) analyses clearly reveal that CuSO4 affects the induction and the transcription level of these laccase genes.

The 35.6-mb genome contained 12,218 predicted protein-encoding genes and 287 tRNA genes assembled into 11 scaffolds corresponding with the 11 chromosomes of strain KACC 42780. Based on presence of copper binding region and signal peptide, 8 laccase genes (Fv Lac-1, Fv Lac-2, Fv Lac-3, Fv Lac-4, Fv Lac-5, Fv Lac-6, Fv Lac-7, Fv Lac-8) were selected in F.velutipes genome. The laccase genes of F.velutipes ranged from 1,300 to 1,700 base pair in their size. In addition, the molecular mass and PI values of laccase genes ranged from 50 to 62 kDa and from 3 to 11, respectively. In laccase activity assays, the highest laccase activity (3unit/ml)was shown in medium with 0.5mM of CuSO4 on 9th day. However, laccase activity was severely decreased in medium with 1mM and 2mM of CuSO4 was drastically decreased from day 3 through day 9. Interestingly, laccase activity in the medium without CuSO4 showed higher level than in the medium with 0.25, 1 and 2mM on both 6th and 9th day. RT_PCR showed the highest transcription level with 0.25mM and 0.5mM of CuSO4 supplementation on day 3 and on day 9, respectively. In addition, the transcription level of Lac-1 increased depending on concentration of CuSO4 supplementation.

리그닌은 페닐프로판을 기본단위로 하여 구성된 방향족 거대분자로서 탄소-탄소 그리고 에테르 결합형으로 연결되어 있는 고분자 화합물이며 3차원적인 그물모양의 구조로 일정한 규칙성이 없고 난분해성이다. 리그닌 분해대사에 관여하는 미생물 중 특히 담자균류 중 백색부후균이 리그닌 분해력이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 백색부후균은 리그닌은 잘 분해하지만 그 분해정도는 공기 중의 산소와 질소 농도, 보조기질의 첨가 그리고 배지조성의 성분 및 pH 등이 리그닌 분해에 크게 영향을 미친다고 알려져 있다. Laccase는 리그닌 분해효소 중 하나로서 대부분 균류와 고등식물에서 발견되며 다양한 페놀 화합물에 대해 반응을 하기 때문에 laccase mediator system의 잠재력에 관한 연구가 집중되고 있다. 사과박에는 이러한 페놀 화합물이 다량으로 함유되고 있는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 사과박 추출물 처리에 의한 버섯 균사체의 laccase 유전자 발현변화와 단백질 성분변화를 확인하고자 하였다. RT-PCR을 통해 유전자 발현의 분석 결과 일반배지에 비해 2배 정도 높았다. 또한 1DE와 2DE로 분비단백질을 분석한 결과 사과박 추출물의 첨가 농도에 의존적으로 단백질의 양이 증가함을 확인할 수 있었으며, 2DE를 통하여 사과박 첨가 유무에 따라 분비단백질의 발현 양상이 상이함을 확인하였다. 결과적으로 이 실험을 통해 사과박 추출물은 버섯 균사체의 laccase 유전자 발현을 증가시키며 분비단백질의 발현 양상에 큰 변화를 주는 것으로 확인되었다.

Many researchers reported biodegradation of environmental pollutants by white-rot fungi. Toward in situ bioremediation, we have investigated biodegradation of environmental pollutants by litter-decomposing fungi. In our results, lignin-degrading enzymes produced from litter-decomposing fungi are thought to participate in degradation of pentachlorophenol (PCP) and 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-DA). Then, we examined the biodegradation of PCP, 2,4-DA and the analogs of 2,4-DA by purified laccase and the role of redox mediator on laccase reaction. Laccase purified from Calvatia craniiformis decomposed phenolic compounds, PCP and 2,4-dichlorophenol (2,4-DP), but not non-phenolic compounds, 2,4-DA and 2,4-dichlorophenoxy ethanol (2,4-DE), even in the presence of redox mediators. To clarify the reaction mechanism between the substrates and redox mediators, quantum chemical analysis was applied using MOPAC 2009 and Gaussian 03. The results of the heat of formation and the perturbation energy showed that even redox mediator radicals could not oxidize the non-phenolic compounds. Previously several reports showed that laccase-redox mediator systems decomposed non-phnolic compounds, but we propose that the system could not react on the chlorinated aromatic compounds based on the result of quantum analysis.

laccase 유전자를 겨울우산버섯 내에서 발현을 증가시 켜 리그닌 분해효소의 활성을 강화시키고 리그닌 분해능 이 강력한 균주를 얻고자 형질전환을 시도하였다. 겨울우 산버섯 형질전환용으로 개발한 pHYgpt 벡터에 laccase 유전자를 삽입하여 과발현용 pHYlac1 벡터를 제작하여 REMI 방법으로 형질전환을 실시하였다. 항생제가 포함된 선발배지로부터 각각 13와 28개의 균사체를 선별하였고 여기서 genomic DNA를 분리하고 벡터 primer로 PCR 수행하여 pHYgpt는 9개, pHYlac1는 23개의 형질전환체 가 확인되었다. 염료 (Poly R, RBBR)가 첨가된 고체배지 에 형질전환 균사체를 배양했을 때 pHYlac1 형질전환체 는 야생형 균주에 비해 비교적 높은 탈색능을 보였다. 액 체배지 배양에서 laccase활성을 조사하기 위해 배지의 상 등액과 o-tolidine을 반응시켜 산화에 의해 나타나는 발 색의 정도를 분광기로 측정하였다. 벡터의 형질전환체는 전체 배양기간에서 야생형 균주와 활성이 비슷하게 나왔 으며 laccase가 과발현되는 pHYlac1의 형질전환체는 전 배양기간에서 높은 활성을 보였다. 배양기간과 균주에 따 라 차이는 보였지만 20일 전후에서 야생형 균주에 비해 10배에서 50배 이상 높은 활성을 보였다. 본 연구에서 형 질전환용벡터와 형질전환법을 통해 분자생물학적 기술을 이용한 분해능이 우수한 균주를 개발할 수 있는 형질전환 시스템이 안정적적으로 확립되었으며 앞으로 형질전환 체를 이용한 리그닌 분해와 이와 유사한 구조를 갖는 환경 호르몬의 분해를 위한 기술 개발에 적용할 예정이다.

Laccase는 균류와 식물에서 광범위하게 알려진 효소로 서 다양한 기질에 대하여 촉매반응을 나타낸다. 오래 전부 터 펄프산업에서 리그닌의 제거와 섬유소의 표백작업, 그 리고 오염된 물과 토양의 복원 등의 여러 응용성에서 잠재 적인 산업적 효소로서 주목을 받고 있다. 현재는 버섯의 자 실체로부터 세포내 효소의 작용에 대한 연구가 시작되었 으며, 최근에는 표고버섯의 자실체에서 laccase가 melanin의 생합성에 중요한 역할을 하고 있음이 보고된 바 있다. 이에 우리는 일정한 조건에서 특정한 색의 갓을 보이 는 느타리버섯에서 흑색 및 갈색을 나타내는 색소인 melanin과의 연관성을 laccase의 효소활성으로 확인고자 하였다. 시료는 느타리버섯에서 분리한 흑색 및 백색의 갓 색 변이체를 사용하였으며, 생활 주기와 자실체의 부위별 로 나누어 각각 효소활성을 측정하여 비교하였다. 버섯시 료를 sodium phosphate 완충액에서 homogenizing한 후 원심분리하여, 그 상등액을 조효소액으로 사용하였다. Laccase 활성은 McIlvaine 완충액상에서 2,2'-azinobis(3-ethylbenthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS)를 기질로 사용하여 효소와 반 응시켰으며, ABTS의 산화에 의해 생성된 산화물을 ELISA를 통해서 측정하였다. 그 결과, laccase 효소활성 은 갓 색 변이체(흑, 백색)의 자실체 중에서 흑색 자실체가 가장 높았으며, 생활주기별(균사체, 원기, 자실체, 포자)에 서는 균사체가 가장 높았다. 또한, 느타리버섯의 자실체 부 위별(갓, 갓껍질, 갓주름, 줄기)에서는 갓 껍질이 가장 높 은 것으로 확인되었다.