바이오산업의 발전으로 의약품, 식품 등의 생산 과정의 분리/정제 공정에 사용되어 왔던 기존의 컬럼 크로마토그 래피를 대체하여 더 높은 처리효율을 갖는 막 크로마토그래피가 부상하고 있다. 본 연구에서는 서로 다른 기공 크기의 두 가 지 상용 셀룰로오스 아세테이트(Cellulose acetate, CA) 분리막을 탈아세틸화 과정을 통해, 리간드의 개질이 용이한 다공성 재 생 셀룰로오스 지지체를(Regenerated cellulose, RC) 제조하였다. 음이온 교환능을 부여하고자 grafting을 수행하였으며, 구체 적으로는 UV 중합법을 통해 4차 암모늄을 포함하는 음이온 교환 리간드(MAPTAC)를 부착하여 음이온 교환용 흡착막을 제 조하였다. 단백질 흡착 용량은 정적 흡착 용량(Static binding capacity, SBC)시험을 통해 총 단백질 흡착 용량을 측정했고, 동 적 흡착 용량(Dynamic binding capacity, DBC)을 측정하여 상용막과 비교 평가하였다. 성능 평가 결과 단백질 흡착량은 넓은 표면적에 의해 리간드 밀도가 높은, 기공 크기가 작은 순서로 높게 측정되었고, 상용 CA분리막을 탈아세틸화하고 리간드를 부착시킨 분리막(RC 0.8 + MAPTAC 43.69 mg/ml, RC 3.0 + MAPTAC 36.33 mg/ml)이 상용 막 크로마토그래피 제품(28.38 mg/ml) 대비 높은 흡착 용량을 보였다.

BSA 용액의 전량 한외여과에서 막모듈의 중력에 대한 경사각(0~180°) 변화에 따라 유발된 자연대류 불안정 흐름 (natural convection instability flow; NCIF)의 막오염 제어 효과를 플럭스 증가 정도로 측정하고 막힘여과 모델로 해석하였다. 막모듈의 경사각이 0°에서 180°로 커질수록 NCIF 유발이 증가하여 막오염 제어 효과가 커져 플럭스가 증가하였다. NCIF의 유발이 가장 큰 경사각 180°에서의 플럭스 값을 NCIF의 유발이 없는 0°에서의 값과 비교한 결과, 2시간의 단기간 운전에서는 플럭스 향상성이 5배, 20시간의 장기간 운전에서는 17배까지 증가하였다. 막힘여과 모델을 적용하여 NCIF의 유발에 따른 플럭스 증가 효과를 해석한 결과, 운전시간 15분 이내에서는 중간막힘 모델 그 이후에는 케이크여과 모델로 해석하는 것이 타당하였다. 막모듈 경사각 180°에서 유발된 NCIF는 15분 이내의 운전 초기에는 중간막힘 오염을 67%까지 감소시키고, 그 이후의 운전 시간에서는 케이크층 오염을 99.9%까지 감소시켰다. 따라서 막모듈에 유발된 NCIF의 주된 막오염 제어 기작은 케이크층 형성을 억제시키는 것이었다.

In our previous studies, the cardiac xenotransplantation from an alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pig (GT-MCP-MCP) to cynomolgus monkeys showed a mean survival of 38 days. The objective of this study is to genetically upgrade the GT-MCP-MCP pig, to further enhance membrane cofactor protein (MCP) expression and to express an endothelial specific thrombomodulin (TBM). MCP is a complement regulatory protein and TBM is a coagulation inhibitor. As the dicistronic cassette for wild-type-based MCP and TBM concurrent expressions does not show any increase of MCP, we optimized the MCP codon usage (mMCP) and substituted mMCP for MCP. When the mMCP-TBM cassette was transfected to HeLa cells, we were able to find an increased expression of MCP and endothelial cell-specific TBM expression. The cassette was then transfected into ear-skin fibroblasts isolated from one-month-old #23-4 of a GT-MCP-MCP pig, and the cell populations expressing MCP were obtained by MACS cell sorting. We performed a single cell culture of the selected cells, and obtained clones over expressing 90% MCP. The cells of a clone were used as a donor for nuclear transfer and generated GT-MCP/-MCP/mMCP/TBM pig. The transgenic pig was confirmed to be carrying the cells expressing MCP and functioning as an inhibitor against the cytotoxic effect of normal monkey serum, comparable with donor cells. Thus, we believe that the GT-MCP/-MCP/mMCP/TBM transgenic pig would be potential for the prolongation of xenograft survival in the recipients.

Transplantation is considered to be a very useful approach to improve human welfare and to prolong life-span. Heterologous organ transplantation using pig organs which are similar to human beings and easy to make mass-production has known as one of the alternatives. To ensure potential usage of the pig organ for transplantation application, it is essentially required to generate transgenic pig modifying immuno-related genes. Previously, we reported production of heterozygous α 1,3-galactosyltransferase (GalT) knock-out and human membrane cofactor protein (MCP) expressing pig (GalT-MCP/+), which is enforced for suppression of hyperacute and acute immunological rejection. In this study, we reported generation of homozygous pig (GalT-MCP/-MCP) by crossbreeding GalT-MCP/+ pigs. Two female founders gave birth to six of GalT-MCP/-MCP, and seven GalT-MCP/+ pigs. We performed quantitative real-time PCR, western blot, and flow cytometry analyses to confirm GalT and MCP expression. We showed that fibroblasts of the GalT-MCP/-MCP pig do not express GalT and its product Gal antigen, while efficiently express MCP. We also showed no expression of GalT, otherwise expression of MCP at heart, kidney, liver and pancreas of transgenic pig. Taken together, we suggest that the GalT-MCP/-MCP pig is a useful candidate to apply xenotransplantation study.

Xenotransplantation of pig organs into primates results in fatal damage, referred as hyperacute rejection (HAR), and acute humoral xenograft rejection (AHXR), to the organ graft mediated by antibodies pre-existing and newly-producing in primates against their cognate pig antigens. Functional ablation of α1,3-galactosyltransferase (Gal-T KO) of pig which is an enzyme involved in synthesis of Gala1-3Galb1-4GlcNAc-R antigen is essentially required to prevent HAR. Moreover, additional genetic modification under Gal-T KO background for enforced expression of human complement regulatory proteins which can inhibits complement activation is known to effectively imped HAR and AHXR. In this study, we constructed a membrane cofactor protein (MCP) expression cassette under control of human EF1α promoter. This cassette was inserted between homologous recombination regions corresponding to Gal-T locus. Subsequently this vector was introduced into ear skin fibroblasts of female pig by nucleofection. We were able to obtained 40 clones by neomycin selection and 4 clones among them were identified as clones targeted into Gal-T locus of MCP expression cassette by long-range PCR. Real time RT-PCR was shown to down-regulation of Gal-T expression. From these results, we demonstrated human EF1α promoter could induce efficient expression of MCP on cell surface of fibroblasts of female pig.

본 연구는 고온과 고습 조건 하에서 양파 화구의 총 단백질 발현과 원형질막 H+ATPase 영향을 조사하고자 조생종 '신선황'과 중생종 '맵시황'를 이용하여 실험을 수행하였다. '신선황'과 '맵시황' 품종의 양파 회구 개화전, 반개화, 그리고 만개 단계에서 단백질의 양생에는 차이를 보이지 않았지만 결실 단계에서는 유도 및 비유도되는 단백질이 현저하게 나타났다. 양파 화구 개화 후 실시한 고온과 고습처리 18일째의 양파두 품종의 단벡질도 현저하게 감소하였고 특히 고온처리구에서 더 감소되는 경향을 보였다. 원형절막 H+ATPase 발현을 western-blot으로 살펴본 결과, '신선황' 과 '맵시황'의 경우 대조구에서 원형질막 H+ATPase 단백질 발현이 유지 되는 반면에, 고온처리구에서는 두품종 모두 원형질막 H+ATPase가 발현 되지 않았다. 고습처리구에서 중생종 '맵시황'약 원형질막 H+ATPase는 발현 되었는데 조생종 '신선황'에서 발현되지 않았다. 이는 양파 종자 성숙단계에서 고온 조건을 조우하면 고습처리 보다는 단백질 및 원형질막의 H+ATPase피해가 더 심각함을 보여 주는 결과이다.

본 연구의 목적은 나노복합막을 제조하여 가수분해된 세리신 용액에 함유되어 있는 염의 제거 거동을 살펴보는 것이다. 계면중합법으로 나노복합막을 제조하고 상용화되어 있는 나노복합막과 탈염 거동을 비교하였다. 세리신 용액은 단백질 분해효소에 의해서 분해하여 저분자화하였고 전기영동에 의해 분자량 분포를 살펴보았다. 상대투과유량을 조사하여 나노복합막의 막오염 정도를 살펴보았다. 기공크기가 큰 나노복합막이 탈염에 효율적인 것을 확인하였다.

실크 생산공정 중 발생하는 부산물인 세리신을 회수하기 위하여 제조된 폴리에테르술폰 중공사 한외여과 모듈을 운전하였다. 부산물에 함유되어 있는 비누를 염화칼슘을 이용하여 침진시킨 후 침전된 비누가 함유된 세리신 용액의 침지형 및 가압형 모듈 운전 시 막오염 거동을 살펴보았다. 또한 가압형 모듈 운전 시 비누와 단백질이 막오염에 미치는 영향을 조사하였다. 비누를 제거함으로써 막오염이 줄어드는 경향을 보였다. 이로부터 비누가 침전될 때와 침전되기 전에 단백질 상호간에 영향을 끼치며 분리막에도 영향을 미침을 보여주고 있다.

불용성 농축어육단백질(fish protein concentration, FPC)의 기능성을 개선하기 위한 목적으로 한외여과막 반응기 (MWCO 5,000)를 사용하여 효소적 가수분해를 시도하였다. 막반응기에서 불용성인 FPC의 막힌현상(fooling)을 완화시키기 위하여 회분식에서 pepsin으로 1차 가수분해하였으며, 그 가수분해물을 한외여과막 반응기에서 pronase E를 사용하여 2차 가수분해하였다. 회분식에서 FPC의 최적가수분해 조건은 45℃, pH 2.0, 기질 대 효소비 150 (w/w)였으며, 이때의 가수분해도는 약 89%였다. 회분식에서 반응속도 상수 Km 및 Vmax는 각각 1.25%, 0.89 mg/mℓ/min이었으며, 기질농도 1.5% 이상에서 기질저해가 있었다. 한외여과막 반응기는 순환속도 474 mℓ/min, 투과압력 15 psi로 작동하였으며, 온도에 따른 투과유속은 증가하였으나 pH에 대해서는 거의 일정하였다. 막반응기에서 기질과 2차 가수분해효소 pronase E의 비 (S/E)는 200 (w/w)이 가장 효율적이었으며, 이때의 가수분해물의 생산량은 효소 mg당 702 mg으로 회분식 51 mg에 비해 13배 이상 높았다. FPC 가수분해물의 분자량은 1차 가수분해물의 경우 2,500~20,000 Da 영역에 분포하였으며, 2차 가수분해물은 700~10,000 Da 이었다.

Polysulfone 재질의 다공성 평판막 및 실관막에 키토산 피막층을 형성시킨 후 반응성 염료인 Cibacron Blue 3GA를 고정화시켜 human serum albumin(HSA)의 결합용량이 최대 70 μg/cm2인 단백질 친화성 막을 제조하였다. 친화성 평판막 모듈을 대상으로 HSA에 대한 용출 크로마토그래피 실험을 수행하여 eluent 용액의 최적 환경조건을 결정하였는바, 1M KCl이 첨가된 농도 0.06 M, pH 10의 universal buffer를 eluent로 사용했을 때 리간드와 결합된 단백질의 용출이 가장 우수하였다. 친화성 평판막 및 실관막 모듈을 대상으로 HSA의 전열 크로마토그래피 실험을 수행하여 단백질에 대한 동적 결합용량을 측정하였다. 이 결과 동적 결합용량은 평판막 모듈의 경우에는 loading 용액의 유량과 HSA의 농도가 증가함에 따라 평형 결합용량 값으로부터 크게 감소하였으나, 실관막 모듈의 경우에는 loading 용액의 유량과 HSA의 농도에 관계없이 항상 평형 결합용량 수준을 유지하였는바, 따라서 실관막 모듈이 평판막 모듈보다 단백질 친화성 크로마토그래피 분리관으로서 더 효과적이었다

한외여과막 반응기에서 gelatin 및 bovine serum albumin(BSA) 용액을 한외여과막(MWCO 5,000)으로 여과시 작동시간, pH, 온도, 농도 및 단백질 가수분해 효소의 첨가가 투과유속에 미치는 영향에 대하여 검토하였다. 한외여과막 반응기의 작동시간에 따른 gelatin 용액의 투과유속은 작동시간 20분까지 약간 감소하다가 그 이후에는 18.9l/m2· hr로 거의 일정하게 유지되었으며, BSA 용액은 작동시간 40분까지 완만하게 감소하다가 그후 6.4l/m2· hr로 초기유속의 66%가 감소하였다. 온도에 따른 gelatin 용액의 투과유속은 온도가 올라감에 따라 비례적으로 증가하였다. BSA 용액은 60℃에서 투과유속이 가장 높았으며, 30~50℃ 범위에서는 온도의 영향을 받지 않았다. pH 변화에 따른 gelatin 및 BSA 용액의 투과유속은 10psi 이상에서 각각의 등전점 영역인 pH 5.0에서 가장 낮았다. 투과압력 30psi에서 1% 및 6%(w/v) gelatin용액의 투과유속은 각각 43.0l/m2· hr 및 13.5l/m2· hr 였으며, BSA 용액의 경우는 1% 및 4%에서 33.0l/m2· hr 및 14.0l/m2· hr로 농도가 증가됨에 따라 각각 68.6% 및 57.6% 감소하였다. Gelatin 및 BSA 용액에 단백질 가수분해효소의 첨가에 의한 투과유속은 gelatin 및 BSA의 저분자화에 의한 점도의 감소로 효소를 첨가하지 않은 것보다 30% 향상되었다.