An allo-octoploid strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) is one of the most important vegetable crops in Korea. However, there were few genomic researches of strawberry due to polyploidy and complexity of its genome. In this study, we aimed to construct a genetic linkage map of strawberry using single nucleotide polymorphism (SNP) markers that were developed through a next-generation sequencing (NGS) analysis. Two strawberry varieties, ‘Sulhyang’ and ‘Senga-sengana’, were used as a maternal and a paternal parent, respectively, and their F1 generation consisting of 94 individuals was used for construction of a genetic linkage map. A total of 19.0 Gbp (‘Sulhyang’) and 21.8 Gbp (‘Senga-sengana’) of genomic sequences were obtained through NGS analysis. Subsequently, approximately 87,000 SNPs were identified and 1,154 primer sets for high-resolution melting (HRM) analysis were designed through bioinformatic analysis. In result, a total of 224 polymorphic HRM markers were developed and 205 markers were mapped on the genetic linkage map of strawberry, which total length was 800.8 cM and the number of linkage groups were 30. This SNP-based genetic linkage map and the 224 SNP markers will be very helpful for the genomic and genetic researches of allo-octoploid strawberry.

고추에서는 역병, 탄저병, 바이러스병 등이 큰 피해를 주고 있기 때문에 내병성 및 고품질계 고추 품종 육성의 중요성이 지속적으로 증가하는 상황이다. 때문에 현재 개개의 분자표지를 한번에 1개씩 분석하는 시스템에서 다수의 분자표지로 고추의 유전자형을 빠르고 정확하게 분석할 수 있는 시스템 개발이 절실히 필요하다. 본 연구에서는 Fluidigm 192.24chip을 이용하여 192개의 고추 개체에 대해 24개의 SNP 분자표지를 한 번에 분석하고자 하였다. 이 방법은 한 번의 실험을 통해 4,608개의 data points를 얻을 수 있다. 이를 위해 본 연구에서는 기 개발된 STS 또는 HRM 분자표지를 대량분석이 가능한 Fluidigm용 SNP 분자표지로 전환하고자 하였으며, 총 191개의 고추 샘플과 24개의 내병성 및 웅성불임 분자표지를 이용하여 실험하였다. 실험에 이용된 분자표지는 세균반점병 저항성, 탄저병 저항성, CMV 저항성, 웅성불임성, TMV 저항성, 역병 저항성, CMS 회복유전자, Potyvirus 저항성, TSWV 저항성 분자표지로서 총 24개를 Fluidigm용 SNP 분자표지로 디자인하였다. 식물재료로는 JN F5 분리집단 96점과 고추 유전자원 91점, GMSK F2 분리집단 4점 등 총 191점의 식물샘플을 이용하였고, 나머지 하나는 음성대조군으로 사용하였다. 192.24chip을 분석한 결과 24개의 분자표지 중 19개의 분자표지가 다형성이 구분되는 것으로 판단되었다. 각각의 분자표지에 대한 정확성을 판단하기 위해 기존의 STS 또는 HRM 분자표지의 분석 결과와 비교하였다. 본 연구를 통해 고추의 유용 형질과 연관된 foreground selection용 multiplexing 분자표지를 개발함으로써 신속하고 저렴하게 분자표지를 동시에 분석할 수 있는 기술을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.

고추 탄저병은 국내에서 큰 피해를 일으키는 병 중의 하나이다. 최근에는 우리나라 주요 재배종인 Capsicum annuum에 C. baccatum의 탄저병 저항성을 종간교잡을 통하여 도입한 탄저병 저항성 품종이 보고되고 있다. 고추 탄저병 저항성 품종 육성에 사용된 유전자원은 C. baccatum ‘PBC81’인데, 최근에는 이보다 더 다양한 탄저병 균주범위에 저항성을 보이는 C. baccatum ‘PI594137’을 이용하려고 한다. 따라서 고추의 탄저병 유전자원인 C. baccatum ‘PI594137’의 저항성에 대한 QTL 분석을 수행할 필요가 있는데, C. baccatum과 C. annuum의 종간 후대에서는 종간잡종 불화합성으로 인해 유전자 지도를 그리기가 힘들어 C. baccatum 종내 교잡을 통하여 유전자지도를 작성하였다. 탄저병에 이병성인 C. baccatum ‘Golden aji’와 탄저병에 저항성인 C. baccatum ‘PI594137’을 교잡하여 얻은 F1을 자가수정하여 F2 분리집단 93개체를 유전자지도 작성에 사용하였으며, 양친의 대량 염기서열 분석(NGS)을 통해 찾은 SNP를 바탕으로 HRM 분자표지를 개발하였다. 총 555개의 HRM 분자표지 용 프라이머를 디자인하였으며, 그 중 45.3%인 275개만이 실제로 다형성이 존재하였고, 이를 이용하여 유전자 연관 지도를 작성할 수 있었다. 총 연관거리는 1,057cM이며, 20개의 연관군이 나타났다. Chr. 1, 5 및 6번의 경우 하나의 연관군으로 연결되지 않았으며 나머지 염색체는 모두 하나의 연관군으로 연결되었다. 그리고 reference genome으로 사용된 C. annuum의 physical map과 C. baccatum의 genetic map을 서로 비교하여 보았는데, Chr. 2, 4, 5, 6, 7, 10, 11 및 12의 경우는 약간의 inversion이 있었지만 전반적으로 synteny를 잘 유지하고 있었다. 특히 2개의 translocation을 발견할 수 있었는데, Chr. 1과 8의 translocation 경우는 본 연구 이전에 wild C. annuum, C. frutescens 그리고 C. chinense 등에서도 보고된 것이고, Chr. 3과 9번의 translocation의 경우는 본 실험에서 처음 발견하여 보고하는 것이다. 이 Chr. 3과 9번의 translocation으로 인해 C. annuum과 C. baccatum 사이에 종간불화합이 일어나는 것으로 생각된다. 본 연구 결과는 C. baccatum 종내에서의 최초의 유전자 지도 작성이라는 큰 의미가 있으며, 이를 이용하여 탄저병 저항성 QTL 탐색에 활용될 수 있을 것이며, 또한 C. baccatum의 de novo sequencing 작성에 기초 자료로도 활용이 가능할 것이다.

매운맛은 고추품질에 영향을 주는 주요형질 가운데 하나이 다. 매운맛 분석은 번거롭고 시간이 많이 소요되는 작업이다. 매운맛 분석 효율을 개선하기 위해 본 연구에서는 0.1 N NaOH 와 0.2% 2,6-dichloroquinone chlorimide 용액을 이용한 간 이분석법을 개발하였다. 이 방법을 분무법으로 명명하였는데, 위 분무액을 과피를 제거한 고추 과실에 직접 분무하거나 고 추 절단면이 찍힌 종이 위에 분무함으로써 캡사이시노이드를 5분 이내에 분석할 수 있었다. 분무법의 캡사이시노이드 검출 감도는 40 ppm이었고, 분무법으로 캡사이시노이드 유무, 대 략적인 양, 과에서의 분포를 육안으로 판독할 수 있었다. 분무 법은 고신미 고추 품종을 육성하는 고추 육성 현장에 매우 유 용할 것으로 판단된다. 사

고추 탄저병은 국내에서 아주 피해가 심한 병 중의 하나로 본 연구팀은 십수 년 동안 탄저병 저항성에 대해 유전분석을 수행하는 동시에 저항성 품종 육성에 노력을 기울여 왔다. 이전에 사용하였던 탄저병 저항성 소재는 Capsicum baccatum 종의 PBC81 accession이었는데, 이와 가장 교잡화합성이 높았던 C. annuum 종의 SP21 계통을 모친으로 사용하여 종간 교잡을 수행하였고, 이에 대한 BC1F1과 BC1F2 분리집단에서 QTL mapping을 수행하여 두 가지의 탄저병(Colletotrichum acutatum과 C. capsici)에 대한 각각의 저항성 주동 QTL을 탐색함과 동시에 연관된 분자표지를 개발하였다. 본 연구에서는 탄저병 저항성 소재로 PBC81이 아닌 PI594137과 AR을 사용하여 NGS re-sequencing을 수행한 후 대량의 SNP를 탐색하고자 하였다. PI594137은 C. baccatum 종에 속하며, PBC81보다 좀 더 broad spectrum resistance를 보인다. AR은 AVRDC에서 분양 받은 재료인데, C. chinense Jacq. PBC932의 열성 저항성을 C. annuum에 도입한 계통이다. 탄저병 저항성 QTL mapping은 Golden aji(C. baccatum, 탄저병 이병성)와 PI594137의 F2 분리집단과 SP211(C. annuum, 탄저병 이병성)과 AR의 F2 분리집단에서 수행할 계획이어서 각각의 양친 사이(Golden aji vs. PI594137과 SP211 vs. AR)에서 SNP를 탐색하였다. NGS re-sequencing을 통해 읽혀진 염기서열 총 길이는 PI594137이 40.5Gbp, Golden aji가 12.1Gbp, AR이 12.8Gbp, SP211이 11.5Gbp였다. 이 염기서열을 사용하여 생물정보학적 분석((주)씨더스에 의뢰)을 수행하였는데, PI594137과 Golden aji 사이에서 333,816개, AR과 SP211 사이에서 1,218,595개의 SNP를 최종적으로 탐색할 수 있었다. 탐색된 SNP는 탄저병 저항성 QTL mapping 분석에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

고추 탄저병은 Colletotrichum spp. 균에 의해 일어나고, 국내에는 주로 C. acutatum 종이 우점을 하고 있다. 탄저병 저항성 고추 유전자원은 주로 Capsicum baccatum 종(PBC80, PBC81, PI594137, Cpb 등)에서 주로 보고되고 있으며, C. chinense 종(PBC932 등)에서도 일부 보고되고 있다. PBC81은 C. acutatum과 C. capsici에 모두 우성으로 각각의 주동 QTL에 연관된 분자표지가 개발되었다. AR은 PBC932에서 유래한 육성 계통으로 C. acutatum과 C. capsici에 모두 열성으로 보고되었다. 본 연구에서는 AR 유래 탄저병 열성저항성 유전자와 연관된 분자표지를 개발하고자 하였다. 식물 재료는 대풍초(S) x AR(R) 조합의 F2 분리집단 93개체를 이용하였다. 접종 탄저병 균주는 KSCa-1(C. acutatum)을 사용하였고, 저항성 조사는 DI(disease incidence), OLD(overall lesion diameter) 및 TLD(true lesion diameter) 3가지 방법으로 조사하였다. F2에서 탄저병 저항성이 정규분포 곡선에 가깝게 나타나 QTL mapping을 우선적으로 수행해 보기로 하였다. 연관지도를 작성하기 위해 다른 연구에서 mapping된 마커를 우선 사용하였는데, SSR(200여개), COSII(50여개), STS(20여개) 등 총 270여개의 마커를 스크리닝하였고, 그 중 SSR(45개), COSII(9개), STS(4개) 등 총 58개의 마커가 다형성을 보여 mapping에 사용하였다. 그 결과, 총 512 cM을 커버하는 연관지도를 만들 수 있었고, 이를 이용하여 preliminary QTL 분석을 수행하여 보았다. 그 결과, OLD trait에서 LG9에 저항성 QTL(AR 유래)이 잡히는 것을 확인하였는데, LG9에는 이전 보고에서 C. capsici에 주동저항성을 보이는 부분이 있는 곳이기도 하다. 그리고 TLD trait에서는 LG3에 저항성 QTL(대풍초 유래)이 잡혔는데, 이 부분은 병이 발생했을 때 얼마나 병반이 빨리 커지는지를 설명할 수 있는 형질이다. 현재 각각의 QTL에 아주 가까운 마커를 개발하기 위해 LG3과 LG9에 마커를 추가하는 실험을 계속 진행 중이다.

고추에 함유되어 있는 주요 색소는 카로테노이드(carotenoids) 계열의 물질인 캡산틴(capsanthin), 캡소루빈(capsorubin), β-카로틴(carotene) 등이다. 카로테노이드가 항암, 항산화, 면역력 증가 등에 효과가 있는 것이 알려지면서 고색소 고추 품종에 대한 소비자의 욕구가 증가하고 있다. 따라서, 본 연구에서는 고색소 고추 품종 육성에 활용할 수 있는 총 적색소 간편 분석법을 개발하고자 하였다. 그 결과, 96-wells 폴리스틸렌 마이크로플레이트와 ELISA 판독기를 이용한 분석 방법을 개발하였다. 적색소 측정용 파장 분석에 분광광도계를 이용하지 않고 450nm 필터가 장착된 ELISA 판독기로도 총 적색소 분석이 가능하였다. 하지만 아세톤으로 추출한 색소추출물을 96-wells 폴리스틸렌 마이크로플레이트에 직접 분주할 경우 플레이트 표면이 변색되어 색소를 정확하게 측정할 수 없었다. 그러나 아세톤 색소추출물을 메탄올로 10배 희석한 용액을 사용할 경우, 플레이트 표면과 용액 내 색소 성분에 영향을 주지 않았을 뿐만 아니라 ASTA-20.1법에 의한 색소 측정 결과와도 높은 상관관계를 보였다. 또한 총 적색소 추출 조건으로는 고춧가루 0.1g을 아세톤 10ml에 첨가하고 실온에서 4시간 동안 교반하는 것이 적합하였다. ELISA 판독기를 이용한 색소분석법(Microplate법으로 명명)과 본 실험에서 검정된 색소추출법은 대량의 시료를 처리할 수 있을 뿐만 아니라 아세톤 폐액의 발생량을 ASTA-20.1법의 1/10 수준으로 줄일 수 있어 실제 고추 육종 현장에서 고색소 계통을 선발할 때 매우 유용할 것으로 판단된다.

고추 탄저병은 우리나라는 물론 몬순기후를 갖고 있는 동남아시아의 거의 모든 나라와 중국, 인도 등에서 그 피해가 매우 심각한 병이다. 작년에는 특히 긴 장마로 인해 탄저병 발병이 심하여 엄청난 수확량 감소(홍고추의 경우 대략 50% 이상) 피해를 봤고, 시장에서는 홍고추의 가격이 무려 3배 이상 높게 거래되기도 하였다. 특히 농민들은 비가 올 때마다 농약을 쳐서 농약비용도 아주 큰 부담이 됐다. 따라서 본 과제에서는 지금까지 개발된 탄저병 저항성 계통을 사용하여 하루 빨리 탄저병 저항성 F1 품종을 개발하고 보급해야겠다는 생각으로 여러 종자회사들과 함께 F1 품종 개발에 힘쓰고 있다. 올해 탄저병 저항성 B계통 육성용 33계통(F4세대 30계통, F2세대 3계통), C계통 육성용 106계통(BC2F10세대 36계통, BC2F8세대 47계통, F4세대 23계통), 탄저병/역병 복합저항성 육성용 6계통(F2세대)을 정식하여 육성하고 있다. 특히 작년에는 몇몇 종묘회사의 웅성불임 계통(CMS A계통 또는 GMS 모계)에 본 연구과제에서 개발한 탄저병 저항성 계통을 교배하였고, 올해 총 122개의 F1 조합을 파종한 후 노지포장에 정식하였고, 이들에 대한 탄저병 저항성 및 원예적 특성을 조사할 예정이다. 또한 탄저병 저항성 계통 및 품종을 보호하기 위해 탄저병 저항성 유전자원 Capsicum baccatum ‘PBC81’과 ‘PI594137’ 및 탄저병 저항성 육성계통 ‘2602-14-5’와 ‘2602-27-21’을 NGS sequencing하였고, 염기서열을 비교 분석하였다. 이 결과를 바탕으로 탄저병 저항성 계통 및 품종 보호를 위한 특허를 출원할 예정이다.

고추 매운맛은 캡사이시노이드(capsaicinoids) 물질에 의해 나타나며, 그 중 캡사이신(capsaicin)과 다이하이드로캡사이신(dihydrocapsaicin)이 양적인 측면에서 주를 이루고 있다. Capsicum annuum 종의 피망이나 파프리카는 캡사이시노이드를 합성하는 Pun1(acyltransferase)유전자의 기능이 소실된 pun1(나중에 pun11로 명명) 대립유전자를 가지고 있어 매운맛이 없다. 최근 C. chinense와 C. frutescens 종에서도 매운맛이 없는 고추를 대립성 검정 분석을 하여 Pun1 유전자의 기능이 소실된 또 다른 대립유전자인 pun12와 pun13을 각각 찾아내었다. 또한 C. annuum ‘CH-19 Sweet’에서는 pAMT(putative aminotransferase) 유전자의 기능이 소실되어 매운맛이 나타나지 않는다고 보고하였다. 본 연구에서는 정상적인 Pun1 유전자가 없음에도 불구하고 매운맛이 나타나는 재료를 확보하였고, 이에 대한 유전분석을 수행하였다. 모친으로 사용된 135T는 Pun1/Pun1으로 매운맛이 있는 계통이고, 부친으로 사용된 147BG는 pun1/pun1으로 매운맛이 없는 계통이다. 하지만 147BG계통은 다른 매운맛 계통에 교배하면 F1에서 매운맛 함량이 보다 높아지는 경향을 보이는 계통이다. 135Tx147BG 조합의 F2 집단 85개체에 대해 매운맛(pun1) 마커를 분석하고, capsaicinoids 함량을 HPLC로 측정하였다. 그 결과, 27개체가 매운맛 마커로 pun1/pun1으로 genotyping되었는데, 기존 이론에 의하면 이 개체들은 모두 매운맛이 없어야 하나, HPLC 분석에서 capsaicinoids 함량이 있는 개체들이 있었다. Dihydrocapsaicin은 27개체 모두 검출되지 않았으나, capsaicin은 27개체 중 19개체(함량범위: 2~95mg/100g)에서 검출되었다. 이 결과는 Pun1 유전자가 없어도 capsaicin만을 합성할 수 있는 유전자(Pun3로 명명)가 존재함을 의미한다. 따라서 Pun3 유전자에 연관된 분자표지를 개발하기 위해 집단 크기를 늘려 올해 추가적인 실험을 수행 중이다.

고추(Capsicum annuum)에서 세포질웅성불임성(cytoplasmic male sterility, CMS)의 회복은 하나의 주동 회복유전자(restorer-of-fertility, Rf)와 몇 개의 불임성 변경 유전자(sterility-modifying genes)에 의해 조절된다고 보고된다. 또한 온도에 의해 불임성이 불안정하게 된다는 보고도 있다. 이 중 본 연구에서는 고추의 불완전 임성회복(partial restoration, pr) 현상에 관한 원인을 규명하고 이와 연관된 분자표지를 개발하려고 하였다. 고추의 불완전 임성회복은 웅성불임(S)세포질을 가졌을 때만 나타나는 현상이고, 정상적인 화분량을 보이는 완전 임성회복(S, Rf/Rf)과 정상적인 화분이 전혀 생성되지 않는 안정한 웅성불임(S, rf/rf)의 중간 표현형으로 나타난다. 또한 불완전 임성회복의 화분은 정상과 비정상이 서로 엉켜 붙은 채 개약 후에도 약벽에서 잘 떨어지지 않는 특성을 가지고 있다. 완전 임성회복(Pr/Pr)은 불완전 임성회복(pr/pr)에 대해서 우성이며. 두 개의 F2 분리집단에서 완전 임성회복(Pr/_)과 불완전 임성회복(pr/pr)이 3:1로 분리가 일어나는 것을 확인하였다. 이 분리집단을 이용하여 BSA-AFLP 방법으로 768개의 프라이머 조합을 실험한 결과 pr 유전자좌와 1.8 cM 정도 연관된 두 개의 AFLP 분자표지(E-AGC/M-GCA122와 E-TCT/M-CCG116)를 찾을 수 있었다. 이 중 E-AGC/M-GCA122를 공우성 분자표지인 CAPS 마커로 전환하였고 PR-CAPS라고 명명하였다. 또한 불완전 임성회복(pr)과 회복유전자(Rf)와의 관계를 알아보기 위해 기 보고된 세 개의 Rf 연관 분자표지(OPP13-CAPS, AFRF8-CAPS 및 CRF-SCAR)와 PR-CAPS의 연관분석을 수행하였는데 이들은 서로 아주 가깝게 연관되어 있었다. 또한 A(S, rf/rf), B(N, rf/rf) 및 C(Rf/Rf)를 포함한 91개의 고추 계통에 대해 PR-CAPS(640 bp)와 OPP13-CAPS(1180 bp) 염기서열을 비교분석한 결과 정확히 세 가지로 구분되었다. 이 결과들을 종합해 보면 불완전 임성회복(pr)은 회복유전자좌(Rf locus)의 또 다른 대립유전자라고 생각할 수 있다. 즉, Rf 유전자좌에는 웅성불임을 완전히 회복시키는 Rf와 부분적으로 회복시키는 Rfp 및 회복력이 없는 rf로 구성된다는 것이다. 따라서 pr 유전자를 Rfp (partial restorer-of-fertility)로 재명명하였다. 더 나아가 Rf 유전자좌의 세 개의 다른 대립유전자(Rf, rf 및 Rfp)를 구분할 수 있는 PR-CAPS(MseI과 SphI)와 OPP13-CAPS(HinfI과 BclI) 분자표지를 개발하였다. 이 분자표지는 다음과 같은 육종 과정에 선발마커(marker-assisted selection, MAS)로 유용하게 사용될 수 있을 것이라고 생각한다. (1) 시판 F1 품종의 자식후대로부터 새로운 웅성불임 계통(50%) 및 회복친 육성, (2) 기존 유지친 또는 회복친과 F1 품종과의 교잡을 통한 다양한 유지친 및 회복친 육성, (3) 기존 유지친과 회복친과의 교잡후대로부터 새로운 유지친 육성 및 (4) 기존의 안정한 계통과 불안정한 유지친 또는 회복친과의 여교잡을 통한 안정한 계통 육성 등