본 연구에서 배양액 내 첨가된 macromolecule이 돼지 체외수정란의 체외 발달율에 미치는 영향과 배양소적 내 첨가된 FBS가 후기배발달에 미치는 영향에 대하여 알아보았다. 이에 대한 결과를 요약 하면 다음과 같다. 1. NCSU-23을 기본 배양액으로 사용시 BSA (4mg/ml), FBS (10%), PVA (3 mg/ml)가 각각 첨가되었을 경우 배발달에 큰 차이를 보이지 않았다. 2. PZM을 기본 배양액으로 사용시 BSA (4mg/ml)가

발생학에서 키메라(chimera)는 2개 이상의 다른 유전자형의 세포, 또는 다른 종의 세포로부터 만들어진 1개의 생물개체를 뜻하는 말로, 이는 초기 수정란의 발달과 포유류의 분화를 연구하는데 이용되고 있다. 키메라를 만드는 방법에는 할구와 내세포괴를 응집시키는 방법과 배반포 내에 여러 종류의 세포를 주입하는 방법이 있다 본 실험에서는 서로 다른 두 가지 방법의 활성화 처리법, 즉, ionomycin 처리 후 Cycloheximide (CHX) 또는 6

본 연구의 목적은 inbred 마우스 (C57BL/6J)의 수정란을 이용하여 형질전환마우스를 생산할 때, 수정란이식의 효율성을 증진시키기 위한 것이다. C57BL/6J 및 BCF1 마우스로부터 과배란처리 방법에 의해 수정란을 얻고, DNA를 1 세포기 수정란에 미세 주입한 다음, 1세포기 또는 2 세포기의 수정란을 가임신된 마우스의 한쪽 또는 양쪽 난관에 각각 이식하였다. 1세포기의 수정란을 0.75 d.p.c. 가임신된 마우스의 한쪽 난관에 이식했을 때, 임신율이 C57BL/6J는 68.8±7.83%, BCF1은 48.3±14.22% 이었고, 이식한 수정란 당 산자의 발달율은 C57BL/6J가 11.9±5.51%, BCF1은 10.5±8.03%로 성적이 저조하였다. 그러나, 2세포기의 수정란을 0.5 d.p.c. 가임신된 마우스의 양쪽 난관에 이식했을 때, 임신율이 C57BL/6J는 94.4±9.64%, 13CFl은 100±0% 이었고, 이식한 수정란 당 산자의 발달율은 C57BL/6J가 22.1 ±0.4%, BCF1은 21.8±0.38%였다. 따라서 C57BL/6J 마우스의 2세포기 수정란을 0.5 d.p.c. 가임신된 마우스의 양쪽 난관에 이식하는 것이, BCF1마우스와 유사한 성적을 얻어 경쟁력이 있는 것으로 판단되었다. 이러한 결과에 영향을 미치는 인자가 여러 가지 있을 것으로 판단되지만, C57BL/6J 마우스의 2세포기 수정란을 0.5 d.p.c.가임신된 마우스의 양쪽 난관에 이식하는 방법이 다른 방법보다 형질전환마우스를 생산하는데 효율성이 더 높은 것으로 본 실험에서 확인되었다.

본 실험은 체외에서 한우 난포란의 핵성숙과 그 후의 초기 배발달에 있어서 체외성숙시간이 Polar Body(PB) 출현율, 배 발달율, 배반포의 세포수와 수태율에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과, PB 출현이 체외성숙 시작 후 12시간째까지는 없었고, 14시간부터 20시간째까지 대부분의 난자에서 PB가 출현되었다. 체외성숙 시간에 따른 난할율 및 8 세포기 발달율에서는 차이가 없었으나, 체외성숙 18시간군에서 배반포(31.0±5.7%) 및 8세포기에서 배반포(82.0±5.1%) 발달율이 체외성숙 22시간과 24시간군에 비하여 유의적(P<0.05)로 높았다. 배반포기 수정란의 형성 시기는 체외성숙 18시간군의 배반포는 체외배양 7일과 8일째에 85%가 형성되어 24시간군의 55%에 비하여 유의적(P<0.05)으로 빨랐다. 생산된 배반포의 ICM, TE 및 총세포수는 체내와 체외성숙 18시간 배양 7일째군에서 비슷한 경향을 보였으며, 배양 8일째 처리군들에 비하여 유의적(P<0.05)으로 높았다. 이식 후 수태율은 체내 배반포(56.3%)와 체외성숙 18시간 배양 7일째 군(50%)이 비슷했으며, 배양 8일째군(체외성숙 18시간 16.7% 및 24시간 10.5%)에 비하여 유의적(P<0.05)으로 높았다. 따라서 한우 난자의 핵성숙은 체외성숙 20시간 이전에 대부분이 완료되고, 짧은 체외성숙(18시간)이 배 발달율, 세포수 그리고 수태율 측면에서 효과적이었다.

인체 트롬보포이에틴(hTPO)은 megakaryopoiesis 과정에 주요한 역할을 하는 사이토카인이다. 따라서 이러한 트롬보포이에틴을 유선조직에서 직접적으로 발현시키기 위하여 소 베타 카제인 프로모터, 인체 트롬보포이에틴 cDNA 및 네오유전자로 구성된 발현벡터를 구축하였다. 소 귀조직 세포로부터 유도된 섬유아세포에 lipoffctamine을 이용하여 발현벡터(pBT-L n대)의 삽입을 유도하였다. G4l8 저항성을 지닌 세포의 콜로니 형성을 유도하기 위하여 2주 이상 배양을 실시하였다. 형질전환 콜로니는 PCR에 의해 동정하였으며, 이들 콜로니를 핵치환 전까지 계속적으로 증식을 유도하였다. 형질전환 세포에 의해 재구성된 난자는 전기적인 융합과 calcium ionophore와 6-DMAP를 이용한 활성화를 실시하였으며, 체외에서 7일간 배양을 실시하였다. 총 35개의 콜로니를 PCR에 의해 분석한 결과, 이 중 29(82.9%)개가 형질전환된 콜로니였다. 형질전환된 세포로 재구성된 난자의 난할율 및 배반포로의 발달율은 65.1%와 23.8%로 나타났다. 형질전환된 세포로 재구성된 난자로부터 발달한 29개의 배반포 중 27개가 형질전환으로 확인되었다. 따라서 이러한 결과들은 형질전환 소 수정란을 형질전환된 세포를 이용한 체세포 복제 기법을 통해 효과적으로 생산할 수 있다는 것을 제시하고있다.

본 연구는 한우미경산우에 인공수정 7일째와 복제수정란 이식시 hCG를 투여에 의해 수태율 향상을 위하여 실시하였다 인공수정 후 임신 60일째에 임신감정을 실시한 결과 대조구, CIDR 그리고 hCG를 투여한 결과 53%, 46%, 71%였으며, 처리간에 유의적인 차이를 보였다(P<0.05). 복제수정 란의 이식시 hCG를 투여한 결과 대조구, hCG투여구는 각각 5.8%, 10.4%를 나타냈으며, 유의차는 인정되지 않았다. 인공수정 7일째에 hCG를 투

본 연구는 돼지 체외수정란의 배양시스템의 최적화를 위하여 수행되었다. 기본배양액으로는 NC-SU-23을 사용하였으며, 실험 1에서는 IGF-I이 각각 0, 1, 10, 100 ng/의 농도로 첨가된 배양액에서 배양하여 분할율, 배반포 발달율과총 세포수를 확인하였다. 농도 경사에 따른 분할율은 차이가 없었으나(65.5%~69.5%), 배반포 발달율에 있어서는 10 ng/의 농도로 첨가하였을 경우가 가장 높았다(P<0.05). 실험 2는 배 아 유전자 활성

2001년도 국내에서 실시된 가축의 수정란이식 현황을 파악하기 위하여 전국의 수의·축산분야의 대학, 국·공립 축산관련 연구소, 농업기술센터, 가축 인공수정소 및 동물병원 등의 108개 관련기관에 2001년 1월 1일부터 12월 31 일까지 소, 돼지 및 기타 동물의 수정란 생산, 이식 및 임신진단 결과에 대하여 설문서를 통하여 조사하였으며, 설문서를 작성하여 제출한 51개 기관의 자료를 분석한 결과는 다음과 같다. 가축의 수정란이식을 실시하고 있는 기관은 국림기관 4개소, 지방자치단체 10개소, 대학 11개소, 생산자단체 2개소, 개인 시술소 25개소로 전체 51개소였다. 한우 및 젖소 228두를 과배란 처리하여 회수된 난자수는 1,536개였으며, 그 중 이식가능 수정란 수는 995개로 두 당 평균 4.4개였다. 체외수정의 생산은 OPU유래 244개, 도축난소 유래 20,957개, 복제수정란 8,154개로 29,355개의 이식가능 체외수정란을 생산하였다. 한우에서 수정란이식은 체내수정란 359개, 체외수정란 2,686개, 복제수정란 713개 등 3,758개가 이식되었고, 젖소에는 체내수정란 U개, 체외수정란 120개, 복제수정란 106개 둥 294개가 이식되었다. 이식된 수정란의 상태별로는 신선수정란이 61.7%(2,500개), 동결수정란이 38.3%(1,552개) 이식되었고, 수란우의 품종별로는 한우 수정란을 한우 수란우에 1,471개, 젖소 수란우에 2,287개가 이식되었고, 젖소 수정란을 젖소 수란우 236개, 한우 수란우에 58개가 이식되었다. 수정란이식 수란우의 수태율은 임신진단이 이루어진 체내수정란이식(368 두)은 32.3%, 체외수정란이식(968두)은 40.4%, 복제수정란이식(536두)은 9.3%였다. 기타동물의 체내수정란 생산은 돼지 105두에서 1,623개, 염소 2,662두에서 1,720개, 기타 39두에서 228개의 수정란을 회순 하였으며, 돼지에서 체내수정란 695개, 체외수정란 1,200개, 복제수정란 67,750개 이식되었고, 기타동물에서 58,950개가 이식되었다.

면양과 염소가 최근 수십년동안 세계여러 나라에서 번식생리의 연구를 위한 모델로 사용되어 왔는데, 체내수정란의 생산에 관한 영역도 유럽을 중심으로 활발하게 연구되어왔다. 수정란생산을 위한 발정동기화방법, 과배란처리 및 수정란회수방법 기술은 현재 상당히 많은 기술진척이 이루어진 상태이나, 우리나라 고유의 재래유전자원인 흑염소에는 이를 위한 기술이 미진한 실정이므로 본 실험에서는 흑염소의 체내수정란생산기술을 확립하여 재래가축 유전자원보존을 위한 기초기술을 마련하고자 한다. 축산기술연구소 남원지소에서 사육하고 있는 체중 20kg 이상의 건강한 흑염소를 이용하여 발정동기화를 위해 controlled intravaginal drug release(CIDR)를 질내에 14일 동안 삽입하고, 과배란처리는 FSH를 CIDR 삽입 12, 13, 14일째에 12시간 간격으로 점감법으로 총20mg을 투여하였으며, PGFa를 13일째 FSH와 함께 투여하였다. CIDR는 14일째의 아침에 제거하였다. 수컷과의 교미는 CIDR제거 24시간후에 GnRH를 투여와 동시에 실시하였으며, 채란은 교미후 3일째에 외과적인 방법으로 실시하였다. CIDR처리경과에 따른 progesterone농도는 CIDR 주입시 바로 수치가 상승하여 제거전까지 6~12ng/m1의 농도를 유지하였으며, 제거즉시 2ng/ml 이하로 떨어졌다. 채란시 평균 배란점은 16.5개, 미배란난포 9.8개였으며, 회수수정란은 6.0개를 나타내어 채란율은 36.4%를 나타내었다. 회수된 수정란의 발달단계는 4-cell 78.9%, 2-cell 5.3%, fragmentation 15.8%를 나타내었다. 이와 같은 체내수정란생산방법을 기반으로 하여 이후 수정란의 동결 및 수정란이식기법에 관한 연구를 수행한다면 우리나라의 재래가축인 흑염소의 유전자원 장기보존과 생산성향상에 기여할 것으로 사료된다.배양액에 30 embryos/50ul 소적으로하여 38.8, 5% 의 탄산가스 배양기에서 각각 7일간 배양을 실시하였다. 조사된 결과는 SAS/STAT를 이용하여 통계분석을 실시하였다. 체외수정 12시간 후에 난자 급속 염색법으로 염색을 실시한 결과, 모든 처리구에서 핵성숙률(76.4~95.2%), 정자침투율(51.1~66.9%), 웅성전핵형성률(95.2~100%), 다정자침입률(18.2~25.6%) 및 평균침입정자수(1.2~l.4개)에서 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 체외배양 48시간 난할률을 조사한 결과, 처리구별 차이(53.9~67.9%)는 인정되지 않았으나, 배양 7일째 배반포형성률은 각각 14.5, 25.4, 17.3 및 12.4%로서 25uM의 -ME처리구가 유의적(P<0.05)으로 높은 배발달률을 나타내었고, 총세포수에 있어서는 대조구와 처리구간 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 따라서 돼지 난포란을 성숙배양할 때, 25uM -ME를 첨가배양하는 것이 양질의 돼지체외수정란을 생산하는 하나의 방법으로 조사되었다.다.

Catalase(CAT)는 주요한 활성산소(ROS)의 일종인 과산화수소()가 Hydroxyl 유리기 생성에 관여하지 못하도록 를 및 로 대사시켜 주는 효소계 항산화제의 한 종류이다. 따라서 본 실험에서는 CAT가 5% 및 20% 조건하에서 1-세포기 돼지체외수정란의 배발달에 미치는 영향을 조사하였다. 돼지난포란을 10% PFF, 0.1mg/ml cysteine, 10IU/m1 PMSG, 10IU/m1 hCG 및 10ng/m1 EGF가 첨가된 NCSU23 배양액에서 22시간 동안 배양을 실시하고, 성선자극호르몬이 배제된 배양액에서 추가로 22시간을 배양하여 체외성숙을 유도하였다. 체외성숙이 유기된 난자는 난구세포를 제거하고, 2.5mM caffeine과 0.1% BSA가 첨가된 mTBM 배양액에 정자를 1.25 cells/ml의 농도로 5-6시 동안 공동배양을 실시하여 체외수정을 유도하였다. 체외수정후 1-세포기의 수정란을 0.4mg/ml BSA가 첨가된 NCSU23 배양액에 CAT를 각각 0, 100, 500 및1,000uni1 첨가하여 30 embryos/ 50u1 소적으로하여 38.8, 5% 및 5%, 5% 90% 조건하의 배양기에서 각각 7일간 배양을 실시하였다. 조사된 결과는 SAS/STAT 6.03 Package를 이용하여 통계분석을 실시하였다. 체외배양 48시간에 난할률을 조사하였을 때, 대조구와 처리구간 차이가 인정되지 않았으나, 배양 7일째 배반포형성률에 있어서는 각각 22.72.7, 22.13.9, 18.74.9, 및 15.12.5%로서 처리구가 대조구보다 유의적으로 낮은 결과를 나타냈다. 그리고 산소농도에 따른 배반포형성률은 5% 조건(22.12.4%)이 20% 조건(17.22%)보다 유의적(P<0.05)으로 높은 것으로 나타났다. 총세포수에 있어서는 각각 44.44.0, 43.336, 25.42.4 및 13.41.5로서 처리구가 대조구보다 세포수가 적은 것으로 나타났으며, 산소농도에 따른 차이는 인정되지 않았다. 따라서, 체외생산된 돼지초기수정란을 배양할 때, CAT의 첨가는 효과가 없는 것으로 나타났다.다.

Mercaptoethanol(-ME)은 일반적으로 황화합물(thiol compounds)의 일종으로, 배양액 중에서 이황화결합(disulfide bonds)을 분해하여 일정한 물질의 산화.환원반응에 관여하며, 특히 cysteine이 cystine으로 산화되는 것을 차단함으로서 cysteine의 이용능력을 증대시키고, GSH의 합성을 촉진 및 증대시키는 것으로 알려져 있고, 각종 활성산소로부터 세포를 보호하는 역할을 수행하는 것으로 보고되었다. 특히, 돼지수정란의 체외배양체계에 유의적인 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Abebydeera 등, Theriogenol., 50:747-756, 1998). 따라서 본 실험에서는 돼지난포란의 체외성숙시 -ME의 첨가배양이 체외수정과 배발달에 미치는 영향에 관하여 조사하였다. 돼지난포란을 10% PFF, 0.1mg/ml cysteine, 10IU/m1 PMSG, 10IU/m1 hCG 및 10ng/m1 EGF가 첨가된 NCSU23 배양액에 -ME를 각각 0, 25, 50 및 100uM을 처리하여 22시간 동안 배양을 실시하고, 성선자극호르몬이 배제된 배양액에서 추가로 22시간을 배양하여 체외성숙을 유도하였다. 체외성숙이 유기된 난자는 난구세포를 제거하고, 2.5mM caffeine과 0.1% BSA가 첨가된 mTBM배양액에 정자를 1.25 cells/ml의 농도로 5-6시간 동안 공동배양을 실시하여 체외수정을 유도하였다. 체외수정후 일부의 수정란은 12시간에 난자 급속 염색방법으로 염색하여 다정자침입률 및 자.웅전핵형성률 등을 확인하였다. 그리고 나머지1-세포기의 수정란은 0.4mg/ml BSA가 함유된 NCSU23 배양액에 30 embryos/50ul 소적으로하여 38.8, 5% 의 탄산가스 배양기에서 각각 7일간 배양을 실시하였다. 조사된 결과는 SAS/STAT를 이용하여 통계분석을 실시하였다. 체외수정 12시간 후에 난자 급속 염색법으로 염색을 실시한 결과, 모든 처리구에서 핵성숙률(76.4~95.2%), 정자침투율(51.1~66.9%), 웅성전핵형성률(95.2~100%), 다정자침입률(18.2~25.6%) 및 평균침입정자수(1.2~l.4개)에서 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 체외배양 48시간 난할률을 조사한 결과, 처리구별 차이(53.9~67.9%)는 인정되지 않았으나, 배양 7일째 배반포형성률은 각각 14.5, 25.4, 17.3 및 12.4%로서 25uM의 -ME처리구가 유의적(P<0.05)으로 높은 배발달률을 나타내었고, 총세포수에 있어서는 대조구와 처리구간 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 따라서 돼지 난포란을 성숙배양할 때, 25uM -ME를 첨가배양하는 것이 양질의 돼지체외수정란을 생산하는 하나의 방법으로 조사되었다.다.

조류는 발생학적 특성상 수정과 초기 배발생을 제외한 거의 대부분의 개체발생 과정이 난각 속에서 진행된다. 그러므로 수정란에 생명 공학적 기법을 적용하는데 있어서, 포유류의 경우 여러 생명공학 기법이 적용된 수정란은 초기발생을 위한 체외배양 이후 반드시 모체에 이식되어야 하지만, 조류의 경우 인공적인 체외배양 체계가 확립되어 있어야 생명공학 기법이 적용된 수정란을 개체까지 발생시킬 수 있게 된다. 닭의 난자는 난관 누두부에 배란 후 약 15분내에 정자의 침입을 받아 수정되어 난관 팽대부에 도달하면 1세포기 수정란이 된다. 그 후 수정란이 협부에 도달하면 최초로 분할이 일어나기 시작하여, 방란시에는 그 세포수가 60,000개에 이르게 된다. 한편, 계란의 형성 과정에서는 다량의 난황을 포함한 난자가 난관 누두부로 배란되어 정자와 만나게 되면 수정란으로서 계란 형성이 계속되고 정자와 만나지 못하게 되면 무정란으로서 계란 형성을 계속하게된다. 배란된 난자가 난관누두부를 거쳐 난관팽대부에 도달되면 난자는 농후난백에 의해 둘러싸이게 되고 난관혈부에 도달되면 난각막이 형성되고 수양성 난백이 침적하게 된다. 그 후, 난관협부를 지난 난자는 난관자궁부에 도달되면 20시간이상 그곳에 머물면서 난각형성이 진행된 다음 방란된다. 따라서 수정란에 외래유전자를 미세주입하여 형질전환 닭을 생산하기 위해서는 수정란을 암탉의 난관 내에서 최초 분할되기 전에 외부로 끄집어내어야 하며, 수정란에 외래 유전자를 미세주입한 다음에는 다시 암탉의 난관내로 이식해야 하지만 현재까지 그러한 기술은 확립되어 있지 못하다. 그렇기 때문에 모체의 난관 속에서 일어나는 배 발생과 그 이후 개체까지의 발생을 위하여 인공적인 체외배양 체계가 확립되어 있어야 한다. 따라서 본 발표에서는 형질전환 닭을 생산하기 위한 양질의 1세포기 수정란 획득 방법과 획득된 수정란의 체외 배양방법에 관하여 기술적인 측면에서 고찰 해보고자 하며, 그와 같은 배양 기술을 이용하여 외래유전자를 도입한 일련의 결과에 관하여 보고 하고자한다.

본 연구는 체내, 체외 소 배반포기 배의 GMP vitrification 후 활력도의 비교와 한우 수정란을 몽골 소에 수정란이식 후 산자생산 가능성을 조사하고자 실시하였다. 한우 수정란은 체외수정란 또는 과배란처리에 의한 체내수정란을 생산하여 GMP vitrification 방법으로 동결 후 몽고로 수송하였다. 수란우는 CIDR과 처리에 의하여 동기화를 유도하였다 체내수정란생산을 위하여 7두를 과배란처리하였다. 총 64개의 배반포기를 회수하였다. (pe