본 연구는 돼지 난포란의 동결보존 후 생존성과 난자의 활성화 처리에 따른 체외발생율과 이를 이용한 핵 이식배의 체외발생율을 조사하였다. 활성화 처리된 배는 FBS가 첨가된 NCSU 23 배양액으로 , 와 air의 조건으로 배양하였다. 1. 난포란을 EDS와 PVP로 동결 후 FBS가 첨가된 NCSU 23 배양액으로 시간 배양했을 때 체외발생율은 로서 대조군인 비동결 난포란의 체외발생율 에 비해 낮았다. 2. Ethanol과 cyclojexamide로 처

본 연구는 demecolcine 처리에 의한 탈핵과 수핵란 세포질의 세포 주기가 소 체세포 핵이식란의 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 체외에서 16~20시간 성숙배양된 난자를 극체 방출 유무 및 MI, MII기 난자로 구분하여 0.4㎕/mL demecolcine으로 40분간 처리 후 염색체 부위가 돌출된 난자는 탈핵 후 핵이식에 공시하였다. 소의 귀 피부 세포를 탈핵란에 이식하여 전기융합과 활성화 처리(Ca-ionophore+DMAP)를 거쳐 체외 배양하였다. Demecolcine처리 후 86.2%의 난자가 염색체 부위의 돌출을 보여 이 중 98.8%가 탈핵에 성공하였다. Demecolcine은 핵이식란의 발육에 영향을 주지 않았다. 제1극체 방출란 유래 핵이식란의 배반포 발육율은 극체 미방출란 유래 핵이식란에 비하여 유의적으로 높았다(18.2% vs.4.6%, P<0.05). 한편, MI 난자 유래 핵이식란의 분할율 및 배반포 발육율은(69.4%와 5.9%) MII 난자 유래 핵이식란에 비하여 유의적으로 낮았다(96.7%와 23.9%, P<0.05). 본 연구의 결과는 demecolcine 처리가 소 난자의 탈핵에 매우 효과적이며 MII기 난자가 MI기 난자에 비하여 수핵란 세포질로 더 적절하나 극체 미방출란 및 MI기 난자도 비록 제한적이기는 하지만 핵이식란의 배반포 발육을 지원할 수 있음을 보여준다.

본 연구는 NCSU-23과 PZM-3 배양액에 EGF, 와 glucose의 첨가가 돼지 난자의 체외성숙에 미치는 영향과 배양조건을 다르게 하여 계대배양한 섬유아세포를 이용한 핵이식배를 다른 배양액과 산소조건에서 배양하였을 때 체외발생율에 미치는 영향을 조사하였다. 핵이식 배를 20ng/ml EGF를 첨가 또는 첨가하지 않은 NCSU-23 및 PZM-3 배양액에서 배양하였을 때 배반포로의 체외 발생율은 각각 였다. 핵이식 배를 를 첨가 또는 첨가하지 않은

본 연구는 NCSU-23과 PZM-3 배양액에 EGF, 와 glucose의 첨가가 돼지 난자의 체외성숙에 미치는 영향과, 배양조건을 다르게 하여 계대배양한 섬유아세포를 이용한 핵이식 배를 다른 배양액과 산소조건에서 배양하였을 때 체외발생율에 미치는 영향을 조사하였다. 난자를 20ng/ml EGF를 첨가 또는 첨가하지 않은 NCSU-23 및 PZM-3 배양액에서 44시간 배양하였을 때 난자의 체외성숙율은 각각 와 였으며 EGF를 첨가한 배양액에서 배양한

본 연구는 재래산양에서 복제 수정란의 생산효율을 향상시키기 위한 기초 자료를 제시하고자 체세포 핵이식을 실시하여 공핵세포의 종류, 핵이식란의 활성화 처리 방법 및 수핵난자의 조건이 체외발달율에 미치는 영향을 조사, 검토하여 핵이식란 생산을 위한 최적의 조건을 규명하고자 실시하였다. 공핵세포의 종류에 따른 핵이식란의 체외발달율은 융합이 이루어진 핵이식란의 활성화 처리 후 분할율은 귀 유래 섬유아세포를 공핵세포로 사용하였을 때가 로서 태아 유래 섬유아세포를

본 연구는 개의 미성숙난자의 낮은 성숙율을 개선하기 위하여 자연발정온 개의 생식기관에 미성숙 난자를 이식하여 체내 배양 난자를 회수하여 회수된 난자의 핵 성숙율을 조사한 결과는 다음과 같다. 1. 미성숙난자를 24, 48 및 72시간 동안 체외성숙을 유도하였을 때 성숙시간에 따른 체외성숙율에는 유의적 차이는 인정되지 않았다. 2. 체내 배양 기간에 따른 난자의 회수율은 배양기간이 길어질수록 유의적으로 낮은 회수율을 보였으며, 배양기간이 증가할수록 난자의

본 연구는 돼지 태아 섬유아세포유래 공여세포를 미세주입에 의해 주입 후 재 조합한 핵 이식 배에 대한 배양액, 세포주기의 동기화, 배양시간 및 난자의 활성화에 따른 융합율과 체외발생율에 대해 조사하였다. 핵 이식 배를 NCSU-23, TL Hepes 및 TZM-3 배양액으로 1시간 및 8시간 배양하였을 때 배반포로의 분할율은 각각 15.6%, 14.0%, 15.0% 및 13.9%, 10.5%, 13.3%로서 배양액 및 시간에 따른 분할율의 유의적인 차이

본 연구는 재래산양의 핵이식을 실시하여 공여세포의 조건, 전기적 세기 및 융합횟수 등이 융합율과 체외발달율에 미치는 영향을 조사하여 최적의 융합조건을 확립하고자 실시하였다. 공여세포는 귀 유래 섬유아세포와 태아 유래 섬유아세포 2종류를 분리 배양하여 사용하였으며, 수핵란의 채취는 성숙한 미경산 재래산양에 과배란을 유기하여 hCG 투여 후 제 35시간째에 외과적인 방법으로 in vivo (체내성숙)난자는 난관을 관류하는 방법으로 회수하고 in vitro (체외성숙)난자는 난포로부터 흡입하여 난포란을 채취하여 약 22시간 체외성숙을 실시하였다. 수핵난자는 난구세포를 제거한 다음 0.05 M sucrose를 처리하여 세포질이 양호하고 극체가 뚜렷하게 보이는 난자만을 선별하여 핵이식을 실시하였다. 핵이식란의 융합은 전기자극방법으로 융합을 실시하였으며, 핵이식 조작 후 약 3시간 동안 전배양을 실시한 다음 활성화를 유도하였다. 복제수정란은 0.8% BSA가 첨가된 mSOF 배양액으로 6∼7일 동안 체외 배양을 실시하였다. 귀 유래 섬유아세포를 공여세포로 사용하였을 때 융합율은 60.4%로서 태아 유래 섬유아세포의 40.3%보다는 높게 나타났다. 분할율에 있어서는 귀 유래 섬유아세포와 태아 유래 섬유아세포가 각각 47.6 및 48.2%로서 차이가 없었다. 2.40∼2.46 ㎸/㎝로 전기자극을 주었을 때 융합율은 43.8%로서 1.30∼l.40 ㎸/㎝(26.7%)와 2.30∼2.39 ㎸/㎝ (34.8%)가 높게 나타났으며, 융합이 이루어진 핵이식란의 분할율은 82.9(1.30∼l.40 ㎸/㎝), 43.8(2.30∼2.39 ㎸/㎝) 및 51.8%(2.40∼2.46 ㎸/㎝)로서 전기자극의 세기에 따른 유의적(p＜0.05)인 차이는 없었다. 전기융합을 1회 실시하였을 때 in vivo 난자는 43.5%로서 in vitro 난자의 23.6%보다 유의적으로 높게 나타났으며, 2회 실시하였을 때는 55.7(in vivo) 및 39.2%(in vitro)로 in vivo에서 높게 나타났다. 3회 자극을 주어 전체 융합율은 in vivo가 66.1%로서 in vitro의 52.8%보다는 유의적으로 높게 나타났다.

This study was conducted to investigate the developmental ability of caprine embryos after somatic cell interspecies nuclear transfer. Donor cells were obtained from an ear-skin biopsy of a caprine, digested with 0.25% trypsin-EDTA in PBS, and primary fibroblast cultures were established in TCM-199 with 10% FBS. After maturation, expanded cumulus cells were removed by vigorous pipetting in the presence of 0.3% hyaluronidase. The matured oocytes were dipped in D-PBS plus 10% FBS＋7.5 ㎍/ml cytochalasin B and 0.05 M sucrose. The reconstructed oocytes were electrically fused with donor cells in 0.3 M mannitol fusion medium. After the electofusion, embryos were activated by electric stimulation. Interspecies nuclear transfer embryos with bovine cytoplasts were cultured in TCM-199 medium supplemented with 10% FBS including bovine oviduct epithelial cells for 7∼9 day. On the other hand, the NT embryos with porcine cytoplasts were cultured in NCSU-23 medium supplemented with 10% FBS for 6∼8 day at 39℃, 5% CO₂ in air. In caprine-bovine NT embryos, the cleavage(2-cell) rate was 36.8% in confluence and 43.8% in serum starvation. The developmental rate of morula- and blastocyst-stage embryos was 0.0% in confluence and 18.8% in serum starvation. In caprine-porcine NT embryos, the cleavage(2-cell) rate was 76.7% in confluence and 66.7% in serum starvation. The developmental rate of morula and blastocyst stage embryos was 3.3% in confluence and 3.0% in serum starvation, and no significant difference was observed in synchronization treatment between donor cells. In caprine-bovine NT embryos, the cleavage(2-cell) rate of cultured donor cells was 30.8% and 17.6% in 5∼9 and 10∼14 passage(P＜0.05). The developmental rate of morula and blastocyst stage embryos were significantly higher(P＜0.05) in 5∼9 passage(23.1%) than in 10∼14 passage(0.0%) of cultured donor cells. In caprine-porcine NT embryos, the cleavage rate was significantly higher(P＜0.05) in 5∼9 passage(86.7%) than in 10∼14 passage(50.0%) of cultured donor cells. The developmental rate of morula and blastocyst stage embryos were 3.3 and 0.0% in 5∼9 and 10∼14와 passage of cultured donor cells. In caprine-bovine NT embryos, the developmental rate of morula and blastocyst stage embryos were 22.6% in interspecies nuclear transfer, 33.9% in in vitro fertilization and 28.1% in parthenotes, which was no significant differed. The developmental rate of morula and blastocyst stage embryos with caprine-porcine NT embryos were lower(P＜0.05) in interspecies nuclear transfer(5.1%) than in vitro fertiltzation(26.9%) and parthenotes(37.4%).

본 연구는 체세포의 종류, 세포 제공 개체, 계대배양 수 및 세포의 trypsin 처리시간이 소 체세포 핵이식란의 체외발육에 미치는 영향을 검토하였다. 세 종류의 체세포(피부, 근육 및 난구세포) 와 암소 3 개체를 실험에 공시하였으며, 한 개체 유래의 피부세포는 5∼30회 계대배양하였고, 핵이식 전에 1∼3분간 trypsin처리하여 핵이식에 사용하였다. 핵이식과정은 상법에 따라 전기융합법을 이용하였다. 핵이식란의 배반포 발육율은 세포의 종류(16.5∼23.9%)나 개체 간(16.4∼19.5%)에 차이가 없으나, 30회 계대 배양한 세포를 사용한 경우(5.8%)에는 5회(25.3%) 또는 15회(23.5%) 계대 배양한 세포를 사용한 경우에 비해 유의적으로 낮았다(P＜0.05). 또한, 1분간 trypsinization 한 세포를 사용한 경우(30.7%)는 3분간 trypsinization 한 경우에 비해 배반포 발육율이 유의적으로 높게 나타났다(P＜0.05). 본 연구의 결과는 소 체세포 핵이식란의 발육이 체세포의 종류 및 세포 제공 개체에 따라서는 영향을 받지 않으나, passage 수 및 체세포의 trypsinization 시간에 따라서는 영향을 받을 수 있음을 시사한다.

복제수정란 생산에 있어서 수핵란 내 체세포 주입 후 전기적인 융합은 필수과정인데, 이 과정을 거치는 동안 많은 수의 체세포 주입 난자가 융합에 실패하거나 lysis가 일어나게 된다. 본 실험에서는 한우 체세포를 이용하여 핵이식을 실시한 후 수핵세포질과 응합을 시도할 때 전기융합 방법에 따른 융합율과 배발달율을 검토하고자 실시하였다. 공여세포는 한우 귀 세포조직을 채취하여 0.05% trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리한 후 DMEM

본 연구는 난자의 성숙시간, PHA-P 처리 또는 활성화 방법이 소 미수정란의 탈핵, 재구축란의 융합, 활성화 또는 체외발육에 미치는 영향을 검토하였다. 미수정란은 성숙 후 16∼24시간에 탈핵을 실시하고, PHA-P 처리 또는 무처리된 귀 피부세포를 이식 후 전기융합을 실시하였다. 후자의 경우는 융합 전에 PHA-P로 15분간 배양하였다. 융합란은 A23187과 CHXM 혹은 DMAP의 병용처리에 의해 활성화를 유기하고, 7∼9일간 체외배양하였다. 탈핵율은 성숙 후 16∼18시간에 실시한 경우(70.2∼92.3%)가 성숙 후 20∼24시간(44.3∼3.4%)에 비하여 유의적으로 높았다(P<0.05). M-II기 염색체의 위치는 성숙배양 시간이 길어짐에 따라 제 1 극체와의 간격이 멀어졌다. Donor 세포 혹은 재구축란에 PHA-P를 처리한 경우는 무처리구에 비하여 융합율이 향상되었다(P<0.05). 핵이식배의 분할율 및 배반포 발달율은 A23187+DMAP 처리구에서 78.6%와 32.9%로, A23187+CHXM 처리구에 비하여 유의적으로 높았다(P<0.05). 본 실험 결과는 성숙후 18시간에 탈핵을 실시하는 것이 효과적이며, donor세포 또는 융합 전 재구축란의 PHA-P 처리가 융합율 향상시킬 수 있고, 또한, 융합란을 A23187과 DMAP으로 병용처리 함으로써 난자의 활성화 및 배반포 발육율을 향상시켜, 결과적으로 핵이식기술의 효율성을 증진시킬 수 있을 것으로 사료된다.