호접란의 형질전환시스템을 확립하기 위한 제 연구를 수행하였다. 항생제 kanamycin, hygromycin 및 spectinomycin 농도(0, 25, 50, 100, 200, and 400mg·L−1)가 품종별 PLB 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험에서 hygromycin은 25 mg·L−1에서 모든 품종이 괴사하였으므로 형질전환 개체의 선발 항생제로는 hygromycin이 유리할 것으로 보였다. P. ‘Maki Watanabe’ 와 P. ‘Brother Lawrence’ 두 품종에서 형질전환체 선발을 위한 DL-Phosphinothricin (PPT)의 적정 농도는 0.5mg·L−1이었다. 형질전환시 가장 높은 효율을 얻기 위한 공동배양 일수를 결정하기 위한 실험은 Dtps. ‘City Girl’과 A. tumefaciens LBA4404를 이용하여 2단 계로 이루어졌다. 균주와 VW 배지의 1 : 10 현탁액에 균주와 PLB를 감염시킨 결과 1시간 처리구에서 PLB 생존이 가장 많았다. 그런 다음 공동배양한 결과 5일 배양에서 PLB 생존수가 가장 많았지만, 4일 이상의 공동배양할 경우 PLB 조직이 연화가 되고 약해져서 죽게 되었다. 따라서 오히려 3일 공동배양 기간이 적 당한 것으로 판단되었다. 박테리아 균주의 종류가 호접란 PLB의 형질전환에 미치는 효율을 비교하기 위해 A. tumefaciens LBA4404(pTOK233)와 EHA105(pGA643)를 이용하였다. LBA4404 보다 EHA105로 감염시킨 PLB의 생존율이 더 높았다. A. tumefaciens LBA4404(pTOK233) 와 AGL1(pCAMBIA3301)을 이용한 형질전환 실험에서 치상된 PLB가 초기에 백변하는 정도가 LBA4404를 이용한 경우 눈에 띄게 빠르게 나타났고 새로운 PLB 가 유도되는 정도도 매우 낮았다(1% 미만). 반면에 AGL1을 이용한 경우 40% 정도의 새로운 PLB 및 유 식물체 형성율을 나타내었다. 형질전환 실험에서 최종 적으로 hygromycin 저항성 식물체 11개체와 PPT 저 항성 식물체 32개체를 얻어냈으나 진정한 형질전환체 인지는 차후에 더 검정이 되어야 할 것으로 보인다.

단자엽 식물인 보리는 Agrobacterium을 이용한 형질 전환이 비교적 까다로운 편이다. 본 연구에서는 큰알1호, 내쌀보리, 올보리, 새찰쌀보리, 서둔찰보리,풍산찰쌀보 리의 유묘에 알칼리, 산화제, 환원제 등을 처리하여 화학 적 상처를 유발하였으며 이들에 감압진공을 이용한 Agrobacterium 형질전환을 실시한 후 GUS 유전자발현 을 분석하였다. 그 결과, 보리묘 생육을 일부 저하시킬 수 있는 농도의 화학물질 처리는 각기 다른 보리 품종의 형질전환율을 전반적으로 증대시킬 수 있는 것으로 판단 되었다. 화학물 중에서는 특히 hydrogen peroxide 처리 가 비교적 우수한 것으로 나타났다.

신품종 페레니얼 라이그라스를 개발할 목적으로 Agrobacterium을 이용한 효율적인 형질전환 체계를 확립하였다. 페레니얼 라이그라스 성숙종자 유래의 캘러스를 pCAMBIA 3301을 가지는 Agrobacterium EHA105를 이용하여 감염시킨 후 형질전환을 실시하였다. Agrobacterium을 이용한 형질전환에 있어서 중요한 인자로 작용하는 몇 가지 요인에 대한 형질전환 효율을 GUS 유전자의 발현정도로 조사하였다. Agrobacterium 감

In the present study, genotypic variation of Agrobacterium-mediated transformation of Korean Italian ryegrass has been evaluated. Mature seed-derived calli of a total of seven cultivars were infected and co-cultured with Agrobacterium tumefaciens carrying the binary vector pCAMBIA1301, which contains a reporter gene (gus) and a plant selectable marker gene conferring resistance to hygromycin (hpt) in the T-DNA region. The effects of several factors such as callus type and callus age on transformation frequency and the expression of the GUS gene were investigated. The highest transformation frequency (6.7%) was obtained with the Hwasan 101 cultivar when 9-week-old calli (type-I) were inoculated with Agrobacterium. The overall transformation rates of the examined cultivars ranged from 0.4% to 6.7%. GUS histochemical assays, PCR, and southern analysis of transgenic plants demonstrated that transgenes were successfully integrated into the genome of Italian ryegrass. Thus, optimization of transformation frequency and selection of a suitable cultivar of Italian ryegrass may improve molecular breeding of this species.

Perennial ryegrass (Lolium perenne L.) is one of the most important grass species in the world's temperate zones. It is used as high-quality forage in pastures and for recreational use as turf in golf courses, lawns and parks. Genetic improvement of perennial ryegrass is difficult due to its self-incompatibility. Consequently, progress by conventional breeding can be slow. Genetic transformation is an alternative that permits direct introduction of useful genes into a plant's genome and is becoming a powerful tool to complement conventional breeding. To improve environmental stress tolerance and quality of perennial ryegrass by introducing better and useful genes into the genome, we have developed a rapid and efficient transformation system using Agrobacterium-mediated gene transfer system.

Human recombinant IL-32 induces the production of large amounts of several proinflammatory cytokines and chemokines, even in macrophage cell lines by activation of NF-κB and MAPK. The ability of IL-32 to potentiate inflammation is not the sole action of this cytokine. IL- 32 stimulates prostaglandin (PG)E2 in human PBMCs, which are pivotal in inflammation. The development of recombinant protein consisting of IL-32 is of great medical and industrial importance. Agrobacterium strains GV3101 harboring pCAMBIA1304 include IL- 32 vectors were used to infect the mushroom fruiting body pieces. For transformation experiments, fruiting body gill tissue pieces were vacuum infiltrated with the suspension of induced bacteria until the air had been completely purged. Mushroom mycelium appeared at the margins of the tissue pieces after 9 to 14 days on selection medium with hygromycin at 50㎍/㎖. Transformants PCR analyses confirmed that the IL-32 gene was into the genome of Pleurotus eryngii. The present results demonstrating the usefulness of the transgenic technique s in the genetic manipulation and improvement of mushroom.

Human GH (hGH) has been available over 40 years for the treatment of children with GH deficiency. Human growth hormone (hGH) is mainly produced in the somatotrophic cells of the pituitary in brain and is the product of the GH-N gene. Among the edible mushrooms, the king oyster mushroom (Pleurotus eryngii ) is one of the most popular mushrooms in Asia, Europe and North America. The increasing popularity of P. eryngii among consumers is due to its flavor, texture and shelf life. We report a modified Agrobacteriummediated method for the efficient transformation of hGH2 in Pleurotus eryngii . The binary vector pCAMBIA1304 was used for the initial transformation and detected by GUS and GFP. Infiltrated samples transformed with pCAMBIA1304 showed a wider GUS response than the co-cultivated in the 50㎍/㎖ hygromycin selection medium. This transformation technique offers new prospects for the production of useful protein in the genetically improved mushroom.

당근 (Daucus carota L.)은 β-carotene이 풍부하게 함유되어 있는 뿌리채소로서 잘 알려져 있으며 또한 신품종 육성을 위한 Agrobacterium 이용 형질전환도 비교적 용이한 식물로도 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 뿌리 부위를 1 mm 정도의 두께로 얇게 절단한 당근채에 대하여 화학처리에 의한 표면상해를 유발시키고 이에 의한 Agrobacterium 이용 형질전환의 증대를 분석하였다. MTT를 이용한 세포활성분석을 통하여 0.1-0.3% NaOH 또는 1-4% H2O2 용액의 처리 (3 min)가 당근채 세포활성에 미약한 독성을 나타냈으나 각각 그 보다 고농도 처리에서는 육안으로 비교될 정도의 세포활성 저하를 초래하였다. NaOH나 H2O2 처리 후 1/2 x MS배지 (pH 5.7)로 세척한 당근채는 agroinfiltration 및 3 일간의 동시배양을 거쳐 β-glucuronidase (GUS) reporter gene의 발현정도를 비교하였다. 그 결과, 형광법에 의한 GUS 효소활성측정에서 화학물 처리는 10-15 배 이상의 GUS효소의 활성증대가 확인되었다.

농업과학기술원에서는 농업생명공학연구원, (주)마크로 젠, 건국대학교, 한경대학교, 상지대학교, 경북대학교 연 구팀과 함께 국내토종 팽이버섯에 대하여 유전체 완전염 기서열 해독 및 버섯유전체의 기능분석을 위한 연구를 바 이오그린21사업의 유전체개발이용연구단 과제로 수행하 고 있다. 팽이버섯 형질전환 연구는 이 프로젝트의 하나로 서 유전자 기능분석 기반을 구축하기 위한 과제로 국내에 서 수집된 야생팽이균주 (KACC42777)를 대상으로 Agrobacterium을 매개로 한 형질전환을 수행하여 변이 체 pool을 작성하고자 하는 목적을 가지고 있다. 팽이버섯 의 형질전환을 위하여 hygromycin 저항성 스크린의 가능 성을 확인하기 위하여 자실체 주름조직을 이용한 Agrobacterium 형질전환 체계를 확립하였다. 형질전환 용 벡터 strain은 hygromycin 저항성과 gpd promoter를 가지고 있는 AGL1 pBGgHg을 사용하였으며 항생제 농 도 30ug/ml에서 13.3%의 효율로 형질전환체 156개를 얻었다. 형질전환체는 PCR에 의하여 확인하여 유전자삽 입이 확실한 균주는 균총의 특성을 조사하였으며, 형질전 환체 자실체특성을 확인하기 위하여 병재배를 수행하였 다. AMT 방법으로 형질전환되어 얻어진 균주는 Hygromycin resistance gene이 삽입된 위치 주변의 염 기서열을 찾기 위해서 Inverse-PCR 조건을 구명하였다. 염기서열 완전해독으로 얻어지는 정보와 이들 염기서열 정보는 유전자의 기능을 대량분석하는데 유용하게 이용 될 수 있을 것이다. 본 연구에서 얻어진 모든 형질전환체 는 이후의 연구에 사용하기 위하여 특성을 DB화 하고 장 기보존되고 있다. 이 연구과제를 통하여 팽이버섯의 대량 유전자 분리 및 기능분석 기술 확립으로 유용유전자 발굴 시스템을 구축함으로써 새로운 분자육종 소재를 발굴하 여 제공하고, 팽이버섯 형질전환기술의 확립으로 Postgenome 연구 tool로 활용할 수 있을 뿐 아니라 팽이버섯 유전체 해독정보를 기반으로 한 약리작용 및 발현·대사 관련 유전자 기능분석으로 고부가성 생물소재를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구는 온시디움에 있어서 particle bombardment 및 아그로박테리움 매개 형질전환 최적 조건을 구명하 고자 실시하였다. 실험재료는 ‘Sharry Baby’의 PLBs를 사용하였으며, 유전자는 pCAMBIA3301 vector에 삽입 되어 있는 bar와 intron-gus를 사용하였다. Particle bombardment 법에 있어서는 직경이 0.6 μm인 금 입자 에 유전자를 혼합하여 9 cm의 거리에서 1,100 psi 헬륨 가스 압으로 발사하는 것이 유전자 도입에 효과적이었 다. 아그로박테리움 매개법에 있어서는 미성숙 PLBs를 O.D 0.6 정도인 균주에 접종 후 5일간 광조건 없이 공동 배양하는 것이 유전자 도입에 효과적이었다.

환경스트레스에 강한 내성을 지닌 신품종 톨페스큐를 개발할 목적으로 산화스트레스에 의해 강하게 유도되는 SWPA2 promoter 하류에 CuZnSOD와 APX 유전자가 엽록체에 동시에 발현하도록 제작한 벡터를 Agrobacterium법을 이용하여 톨 페스큐에 도입하였다. Hygromycin이 첨가된 선발배지에서 내성을 가지며 재분화된 형질전환 식물체를 pot로 이식하여 기내 순화시킨 후, Southern 분석을 실시하여 본 결과, 발현벡터의 T-DNA

유용유전자 도입을 통한 신품종 오차드그래스를 개발할 목적으로 Agrobacterium을 이용한 효율적인 형질전환 체계를 확립하였다. 오차드그래스 성숙종자 유래의 캘러스를 standard binary vector인 pIG121Hm을 가지고 있는 Agrobacterium을 이용하여 감염시킨 후 공동배양하여 형질전환 시켰다. Agrobacterium을 이용한 형질전환에 있어서 중요한 인자로 작용하는 AS 첨가와 오차드그래스 품종에 따른 캘러스의 형질전환 효율

유용유전자 도입을 통한 신품종 톨 페스큐를 개발할 목적으로 Agrobacterium을 이용한 효율적인 식물체 재분화 및 형질전환에 미치는 몇 가지 요인을 조사하였다. 성숙종자로부터 유도된 캘러스를 형태에 따라 3가지 type으로 분류하였고 type Ⅱ캘러스는 유백색으로 녹색을 띠며 조직적으로 치밀한 상태이며 식물체로의 재분화효율이 52.6%로 가장 높게 나타났다. 또한 재분화 배지에 AgNO3와 cysteine을 동시에 첨가해 준 경우 무첨가구에 비해 캘러스 유도율은 6.7%, 식물체 재분화율은 12% 씩 각각 증가하였다. 캘러스 type 별 형질전환 효율을 조사한 결과 typeⅡ 캘러스는 58.0%로 가장 높은 형질전환효율을 나타내었다. 형질전환체를 PCR 및 PCR-Southern blot 분석을 실시하여 본 결과 발현벡터의 T-DNA 영역이 형질전환 식물체의 genome에 성공적으로 도입되었음을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 확립된 효율적인 형질전환 시스템은 분자육종을 통한 신품종 톨 페스큐의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.