본 연구는 호르몬과 Na-pyruvate의 첨가가 개 미성숙난자의 체외성숙에 미치는 영향을 검토하였다. 개의 발정주기와 관계없이 암캐의 난소에서 회수한 난자를 NCSU-37 배양액에서 72시간 체외 배양하였다. 호르몬의 영향을 검토하기 위하여 배양액 중에 다양한 호르몬을 24{sim}72시간 첨가하여 성숙율을 검사하였으며, Na-pyruvate 첨가 농도의 영향을 검토하였다. E2 단독 첨가구에서는 제2감수분열 중기(MII) 단계까지 성숙이 관찰되었으나(5.7%), 타 처리구에서는 MII기까지의 성숙이 이루어지지 않았다(P<0.05), E2를 6~24시간만 처리하였을 때는 MII기로 성숙되는 난자가 없었으나 72시간 처리하였을 때는 6.0%로 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). Na-pyruvate의 농도를 0.25 mM 첨가한 구보다 2.5 mM 첨가한 구에서 제1감수분열 중기(MI) 단계까지의 성숙율이 증가하는 경향을 보였으나, MII 단계까지의 성숙율은 차이가 없었다. 본 실험의 결과는 개 난자의 체외성숙시 E2가 첨가된 배양액에서 72시간 배양시에 성숙율을 증진시킬 수 있으나, Na-pyruvate의 농도는 개 체외배양에 있어 큰 영향을 미치지 않는 것을 나타낸다.

활성화를 통한 수핵란의 대량확보를 위해 44시간동안 체외 성숙된 돼지 난자를 ethanol, Ca/sup 2+/-ionophore, 6-DMAP 및 cycloheximide의 화학물질들을 사용하여 단위발생을 유기한 후 그들의 가장적합한 처리농도 및 노출 시간을 규명하였다. 1. Ethanol은 10%, 10분 처리가 전핵형성율, 난할율 및 배발달율에 있어 각각 약 53.4%, 51.6%, 그리고 39.9%로 가장 적합한 조건으로 판명되었다. 2. Ca/sup 2+/-ionophore 가장 적합한 난활성화 조건은 25μM에서 2분간 처리한 것이며, 전핵형성율, 난할율 및 배발달율은 각각 약 59.7%, 62.2%, 그리고 43.9%를 보였다. 3. 6-DMAP를 처리하여 돼지 난자의 활성화를 유기하였을 경우 2mM의 농도에서 각각 약 57.3%, 58.4% 및 29.0%의 전핵형성율, 난할율, 그리고 배발달율을 보여 가장 적합한 조건을 보였으며 2시간∼4.5시간 사이의 노출에는 영향을 받지 않았다. 4. Cycloheximide는 5㎍/ml의 농도가 전핵형성율 2.1%, 난할율 47.7%, 배발달율 31.8%로 가장 은 효율을 보였고, 노출시간에서는 4시간∼6시간 동안 처리하였을 때 60.5∼65.8%, 63.6∼66.7% 및 39.0∼39.5%로 가장 적합한 조건으로 판명되었다. 이상의 결과들은 돼지 체외 성숙 난자의 활성화에 있어 각 화학물질들의 적합한 조건을 바탕으로한 중복처리 및 병용처리 조건 확립 및 효율적인 수핵란의 확보에 기여할 수 있을 것이다.

유전적으로 우수한 능력을 보유하고 있으나 정상적으로 번식이 불가능한 젖소 16두를 간이 난자 체취기를 이용하거나 장기공태 젖소 5두를 초음파 난자체취기를 이용하여 미성숙난자를 채취하므로서 체외수정란을 안정적으로 생산하기 위해 채취기기의 효율성과 반복채란에 미치는 영향을 조사한 결과는 다음과 같다. 1 공란우당 채취회수는 간이 난자 체취기 8.8회였고, 초음파기기는 8.8회였으며, 공란우당 평균 회수된 난포란은 각각 4.39개와 4.14개로 채취기기간에

This study was conducted to develop an improved method for oocyte pick-up(OPU) with finger-sensibility using ultrasound-guidance from ovarian follicles in Holstein heifers. Oocytes were aspirated from ovarian follicles of clear-outline (>2mm), obscure-outline and invisible( 2mm) on ultrasound images with 3 different vacuum pressure(40, 80, 120mmHg). Total number of oocytes recovered/follicles were 309/237(130.4%). 113/80(141.3%) and 107/74(144.6%) with 40, 80 and 120 mmHg of vacuum pressure, respectively. Mean number of oocytes recovered was higher in 2 OPU/week (18.35.3) than 1 OPU/week(14.54.1), but this difference was not statistical1y significant. The recovery rates were not affected by the number of OPU as 135.6%(282 oocytes/208 follicles) in 1~20 OPU, 137.7% (168/122) in 21~40 OPU and 148.4%(92/62) in 41~60 OPU, respectively. The proportions of good oocytes (Grades I) recovered were not significantly different by the number of OPU until 40 OPU(12.4% in 1~20 OPU vs 16.7% in 21~40 OPU). However, a significantly(P<0.05) lower recovery rate resulted from more than 40 OPU compared to less than 40 OPU(7.6%). These results imply that more fertilizable oocytes can be produced from invisible-immature follicles by transvaginal aspiration with finger-sensibility from Holstein heifers.

The present study was carried out to produce in vitro fertilized embryos with immature follicular oocytes collected by transvaginal aspiration from Holstein cows. A simple aspiration apparatus consists of two stainless steel tubes, an inner tube (needle holder; 1.2cmdiameter, 55cm long) and an outer tube (1.5cm diameter, 4Scm long), and a hand-operated vacuum pump was used. Under epidural anesthesia, the needle guide was passed into the vagina of the cow to a point next to the cervix. An ovary was placed against the wall of the vagina over the end of the aspiration needle by rectal manipulation. As the needlepassed into the ovary, an assistant was asked to apply vacuum(l00mrnHg) and the ovary was manipulated back and forth in all directions over the needle. When all sites of the ovary was aspirated, the needle was withdrawn and the needle guide was moved to the other side of ovary and the procedure was repeated. When the oocyte aspiration procedure was finished, collected fluid was transported to laboratory. Oocytes surrounded with at least 1 layer of cumulus cells were matured, fertilized and cultured in vitro. The results were as follows; Ninety seven oocytes were collected by transvaginal aspiration from seventeen Holstein cows(5.7 /head). The number of oocytes surrounded with at least 1 layer of cumulus cells were 60(61.9%). Following in vitro maturation, fertilization and culture, the cleavage and development rate to morula+blastocyst were 83.3% and 30.0%, respectively. From this study, transferable in vitro fertilized embryos could be produced with imma- ture follicular oocytes collected by transvaginal aspiration from Holstein cows using a simple aspiration apparatus

소 난자의 시험관내 수정시 이성체인 1, 2 propanediol과 1, 3 propanediol과의 동결보호제의 이용에 대한 독성효과를 조사하였다. 프랑스에 있는 도축장의 난소에서 채취한 미성숙 난자 212개를 시험관내 성숙과 heparin(10g/ml)첨가에 의한 수정 및 배양을 실시하였다. 소 난자의 시험관내 성숙과 수정시 propanediol의 독성효과를 시험한 결과 1,3 propanediol은 80%의 정상 난할분할율과 5.7%의 낮은 다핵분

1966년 석사 과정에서부터 포유류에서 난자 성숙 과정이 어떻게 일어나는가 하는 것이 연구의 시작이었고, 80년 이후부터는 난자 성숙과 배 발생에 관련된 calcium 대사 연구를 하였다. 이 과정에서 자연히 세포 내로 Ca2+가 유입(Ca2+-influx)되는 요인을 밝혀야 했고, 그러다 보니 포유동물의 난자 성숙과 Ca2+-influx의 통로가 되는 Ca2+-channel을 연구하게 되었다. 1990년 후반부터는 포유동물의 난자 및 배에서 Ca2+-channel에 대한 연구를 주 테마로 하였다. 당시에는 이 분야의 논문이 그리 많지 않았으며, 따라서 세계 어느 연구실보다 이 분야에서 pioneer leader였다는 자부심을 가지고 2004년 8월 성진여자대학교 정년퇴임 시까지 연구하였다. 포유동물의 난자 성숙 과정에서 아미노산인 glutamine이 에너지원(energy source)로 쓰이며, protein 합성의 주 재료가 된다는 점을 밝혔는데, 이는 난자 성숙 과정에서 아미노산이 에너지 원으로 쓰이고 있음을 처음으로 밝힌 논문이었다(Bae and Foote, 1975). 이후 Batta와 Kundsen(1980), Burgoyne 등(1979)이 luteinizing hormone(LH) surge 후 cumulus cell enclosed 난자에서는 Ca2+ 농도의 급격한 증가가 일어나는 반면, folliclar fluid 내의 Ca2+ 농도가 감소하였음을 보인 연구 결과를 토대로 Bae(1981)과 Bae와 Channing(1985)에서 calcium on이 난자 성숙에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 처음으로 보고하였다. 그 이전의 Tsafriri와 Bar-Ami(1978)과 Leibfried와 First(1979)는 Ca2+ion이 난자성숙과는 무관하다고 주장하였으나, 이는 실험 과정에서 배양액 내 Ca2+ 농도 계산이 잘못되었음을 증명하였다(Bae and Channing, 1985). 포유동물 난자를 체외에서 배양하면 자발적인 성숙(spontaneous maturation)이 일어나지만, 양서류나 불가사리는 progesterone이나 1-methyladenosine을 처리해야 난자 성숙이 일어난다. 그러나 포유동물의 난자라도 in vivo에서는 LH surge 후 난자 성숙이 시작된다는 점에서 보면 난자 성숙을 방해하는 무엇인가가 있을 것이라는 추정이 가능하고 난자 성숙 억제 물질(oocyte maturation inhibitor, OMI)을 찾아내는 것이 생식생리학 분야에서는 아주 커다란 문제로 부각되어 왔다. Tsafriri, Pomerantz와 Channing(1976)의 논문을 시작으로 많은 연구자들이 이를 연구하였고, 미국 내분비학회에서도 이들을 Gugenheim award를 수여하여 노벨의학상 수상 후보에 오를 것이라는 소문이 자자했다. 또한 미국 생식학회(SSR)에서는 제 1회 연구 논문상, Baltimore에서는 Great Baltimore Women Scientist로 선정되어 상을 받는 등 일약 전국적인 spot light를 받았다. 이 당시 본인 역시 OMI에 대해 이들과 달이 1975년부터 면역학적인 방법으로 접근하였으나, 연구 속도가 느려 1981년에 겨우 논문 하나를 발표하였다. Fast-moving protein과 slow-moving protein의 두 가지 다른 protein이 serum 내에는 없고 follicular fluid 내에 있으며, 생쥐 난자 성숙을 방해하고 있음을 밝혔다(Bae 등, 1981). 이보다 앞서 1979년 4월에 Dr. Channing 실험실에 합류하였는데 당시 Dr. Channing group이 발표한 OMI은 실험적 오류에 의해 생긴 결과였음을 밝혔고, 1980년 이후 Dr. Channing lab에서는 OMI에 대한 논문은 더 이상 발표되지 않았으며, Dr. Channing은 1985년에 암으로 세상을 떠났다. 포유류 배 착상 전 발생과정 중 일어나는 compaction 현상과 부화(hatching) 과정에서도 Ca2+가 필수적임을 보고하였다(Bae 등, 1994, 1996). 생쥐 난자 성숙과 포배기까지 배 발생에 Ca2+는 지대한 영향을 미치고 있지만 정작 Ca2+ion이 어떻게 난자나 배의 세포질 내로 들어 오느냐하는 Ca2+-channel에 대한 연구는 거의 없었다. 일반적으로 Ca2+-channel는 근육, 신경 조직 등에서는 많은 연구가 이루어졌지만, 포유동물의 난자 내 배에서의 연구는 거의 알려진 것이 없었다. 물론 근육이나 신경조직처럼 재료 구하기가 쉬우나, 포유동물의 난자와 배는 양적으로 재료를 구하기가 힘들다는 것도 원인 중에 하나이다. 예로 직경이 80um인 생쥐 난자 3,400개를 모아야 직경이 1.2mm인 개구리 난자의 체적이 되며, 3,400개의 난자를 모으려면 34명의 숙련된 technician이 생쥐 다섯 마리로 1시간이상 걸려 100개의 난자를 모아야 한다는 것이다. Okamoto 등(1977), Bae(1981), De Felici와 Siracusa(1982) 등이 포유동물 난자막에서 Ca2+-channel의 존재를 암시하였으나, Yoshida(1982)가 처음으로 방사성 동위원소 45Ca2+를 사용하여 Ca2+-channel의 존재를 확인하였으나, 어떤 type의 Ca2+-channel인지 밝히지는 못했다. 당시 한국에서는 45Ca2+를 사용하려면 방사능 취급 자격증을 갖고 있어야 하는 어려움으로 Ca2+-channel에 대한 연구를 시작하지 못하였다. 이후 Ca2+-channel에 대한 항체가 생산되자 본인은 항체를 이용한 면역학적 접근으로 생쥐 난자와 배에서 Ca2+-channel에 대한 연구를 시작하였다. 생쥐 난자 성숙 중에 일어나는 membrane potential이 변하는 것은 Na2+-channel을 통한 membrane potential 변화가 일어나는 것이 아니고 Ca2+-channel을 통해 Na2+의 이동이 일어나고, 이로 인해 membrane potential이 변하는 것임을 Yoshida(1983)이 증명하였다. 또한 Yoshida(1986), Peres(19987), 그리고 Blancato and Sayler(1990) 등 역시 Ca2+-channel의 존재를 증명하였으나, 어떤 type의 Ca2+-channel인지 밝히지는 못했다. 포유동물의 난자 및 배에서 Ca2+-channel를 밝힌 연구로는 Bae 등(1998, 1999a and b), Day 등(1998), Mattioli 등(1998), Emerson 등(2000) 등이 전부다. 이 중 Day 등(1998)은 생쥐 배에서 voltage dependent T-type Ca2+-channel을, Mattioli 등(1998)이 voltage dependent P/Q-type Ca2+-channel을, Emerson 등(2000)이 생쥐 2-세포배에서 voltage dependent L-type Ca2+-channel의 존재를 증명하였다. 본인은 Bae 등(1998, 1999a와 b)에서 생쥐 난자에 존재하는 P/Q-type, N-type, L-type의 voltage dependent Ca2+-channel이 존재함을 밝혔으며, Lee 등(2004)에서는 생쥐 난자 체외 성숙 중 성숙이 저해된 난자는 위의 네 가지 voltage dependent Ca2+-channel이 발현되고 있지 않으며, 이로 인해 난자 성숙이 일어나지 못한 것으로 보이며, 이는 생식 생리학의 난제 중 하나인 OMI의 원인 중 한 가지를 밝혀냈다는 점에서 큰 의의가 있다 하겠다.

Phospholipase C (PLC)는 다양한 세포주에서 세포내 신호전달에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으나, 생쥐 난자성숙 과정과 착성전 배아발생 과정에서 PLC의 역할과 발현은 아직 연구된 바 없다. 본 연구에서는 난자성숙과 착상전 배아발생 과정에서 생쥐의 PLC β1과 γ1의 유전자 발현을 조사하기 위하여 한 개의 난자 혹은 배아에서 추출된 total RNA를 사용하여 경쟁적 RT-PCR 방법으로 mRNA를 정량하였다. PL