The Transgenic livestock can be useful for the production of disease-resistant animals, pigs for xenotranplantation, animal bioreactor for therapeutic recombinant proteins and disease model animals. Previously, conventional methods without using artificial nuclease-dependent DNA cleavage system were used to produce such transgenic livestock, but their efficiency is known to be low. In the last decade, the development of artificial nucleases such as zinc-finger necleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas has led to more efficient production of knock-out and knock-in transgenic livestock. However, production of knock-in livestock is poor. In mouse, genetically modified mice are produced by co-injecting a pair of knock-in vector, which is a donor DNA, with a artificial nuclease in a pronuclear fertilized egg, but not in livestock. Gene targeting efficiency has been increased with the use of artificial nucleases, but the knock-in efficiency is still low in livestock. In many research now, somatic cell nuclear transfer (SCNT) methods used after selection of cell transfected with artificial nuclease for production of transgenic livestock. In particular, it is necessary to develop a system capable of producing transgenic livestock more efficiently by co-injection of artificial nuclease and knock-in vectors into fertilized eggs.

This study aimed to produce high-quality blastocysts and establish appropriate microinjection conditions for the introduction of target gene. First, we identified embryo development to the blastocyst stage after microinjection using the CRISPR/Cas9 system on the Cas9 protein or mRNA. As a result, we confirmed that blastocyst development in the Cas9 mRNA injected group significantly increased when compared to the Cas9 protein injected group (p<0.05). However, the blastocyst gene targeting rate increased in the Cas9 protein injected group when compared to the Cas9 mRNA injected group (p<0.05). Next, we treated the injection medium with 10 μg/ml of cytochalasin B (CB), and the microinjected embryos were cultured in CR1-aa medium supplemented with 0.1 μM of melatonin (Mela). Consequently, the blastocyst formation rate significantly increased in the CB treated group (p<0.05). After microinjecting embryos with the CB treated injection medium, we investigated blastocyst formation and quality via Mela treatment. Consequently, the Mela treated group demonstrated significantly increased blastocyst formation rates when compared to the non-treated group (p<0.05). Furthermore, immunofluorescence assay using RAD51 (DNA repair detection protein) and H2AX139ph (DNA damage detection protein) showed an increase in RAD51 positive cells in Mela treated embryos. Therefore, we verified the improvement in knock-in efficiency in microinjected bovine embryos using Cas9 protein. These results also demonstrated that the positive effect of the CB and Mela treatments improved the embryonic developmental competence and blastocyst qualities in genetically-edited bovine embryos.

The production of therapeutic protein from transgenic domestic animal is the major technology of biotechnology. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) is known to play an important role in the growth of the animal. The objective of this study is construction of knock-in vector that bovine IGF-1 gene is inserted into the exon 7 locus of β-casein gene and expressed using the gene regulatory DNA sequence of bovine β-casein gene. The knock-in vector consists of 5’ arm region (1.02 kb), bIGF-1 cDNA, CMV-EGFP, and 3’ arm region (1.81 kb). To express bIGF-1 gene as transgene, the F2A sequence was fused to the 5’ terminal of bIGF-1 gene and inserted into exon 7 of the β-casein gene. As a result, the knock-in vector is confirmed that the amino acids are synthesized without termination from the β-casein exon 7 region to the bIGF-1 gene by DNA sequence. These knock-in vectors may help to create transgenic dairy cattle expressing bovine bIGF-1 protein in the mammary gland via the expression system of the bovine β-casein gene.

The knock-in efficiency in the fibroblast is very important to produce transgenic domestic animal using nuclear transfer. In this research, we constructed three kinds of different knock-in vectors to study the efficiency of knock-in depending on structure of knock-in vector with different size of homologous arm on the β-casein gene locus in the somatic cells; DT-A_cEndo Knock-in vector, DT-A_tEndo Knock-in vector I, and DT-A_tEndo Knock-in vector II. The knock-in vector consists of 4.8 kb or 1.06 kb of 5’ arm region and 1.8 kb or 0.64 kb of 3’ arm region, and neomycin resistance gene(neor) as a positive selection marker gene. The cEndo Knock-in vector had 4.8 kb and 1.8 kb homologous arm. The tEndo Knock-in vector I had 1.06 kb and 0.64 kb homologous arm and tEndo Knock-in vector II had 1.06 kb and 1.8 kb homologous arm. To express endostatin gene as transgene, the F2A sequence was fused to the 5’ terminal of endostatin gene and inserted into exon 7 of the β-casein gene. The knock-in vector and TALEN were introduced into the bovine fibroblast by electroporation. The knock-in efficiencies of cEndo, tEndo I, and tEndo II vector were 4.6%, 2.2% and 4.8%, respectively. These results indicated that size of 3’ arm in the knock-in vector is important for TALEN-mediated homologous recombination in the fibroblast. In conclusion, our knock-in system may help to create transgenic dairy cattle expressing human endostatin protein via the endogenous expression system of the bovine β-casein gene in the mammary gland.

The objective of this study was to investigate the result of in vivo embryo collection and pregnancy rate after embryo transfer using sex-sorted sperm of Korean brindle cattle. Donor Korean brindle cattle superovulation treated by decreasing dose of FSH injection. Embryos were recovered on 7 days after the third artificial insemination. Control group semen straw used artificial insemination contained 20 million sperm. Sex-sorted semen straws contained 4 million sperm or 10 million sperm. As for the result of the recovery of the in vivo embryos derived from sex-sorted sperm, the number of transferable embryos was significantly highly recovered to be 6.20±2.28/donor from the control group and was significantly lowly recovered to be 1.57±1.72/donor from the group treated at a sperm concentration of 10×106 (p<0.05). The number of unfertilized embryo was 0.8±1.30/donor in control group which was significantly lower than the group treated at a sperm concentration of 4×106 (p<0.05). However, there was no significant difference in the number of undeveloped ova between control and treatment groups. Pregnancy rate after embryo transfer was shown to be 35.00% in control group and 12.50% in treatment group. The karyotype analysis of the calf derived from sex-sorted sperm resulted in a similar chromosomal distribution pattern (2n=60, XX) compared to those of common Korean native cattle.

The purpose of this study is to develop transgenic cell line expressing targeted human granulocyte colony stimulating factor (hGCSF) and green fluorescence protein (GFP) genes as well as production of Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) embryos derived from co-expressed transgenic donor cells. Constructed pPiggy-mWAP-hGCSF-EF1-GFP vector was chemically transfected into bovine fetus cells and then, only GFP expressed cells were selected as donor cells for SCNT. Cleavage and blastocyst rates of parthenogenetic, SCNT embryos using non-TG cell and hGCSF-GFP dual expressed SCNT embryos were examined (cleavage rate: 78.0±2.8 vs. 73.1±3.2 vs. 70.4±4.3%, developmental rate: 27.2 ±3.2 vs. 21.9±3.1 vs. 17.0±2.9%). Result indicated that cleavage and blastocyst rates of TG embryos were significantly lower (P<0.05) than those of parthenogenetic and non-TG embryos, respectively. In this study, we successfully produced hGCSF-GFP dual expressed SCNT embryos and cryopreserved to produce transgenic cattle for bioreactor system purpose. Further process of our research will transfer of transgenic embryos to recipients and production of hGCSF secreting cattle.

동물의 장기를 인간에게 이식하게 되면 초급성거부반응(Hyperacute rejection, HAR)이 일어난다. 초급성거부반응은 면역계의 구성요소 중 보체(complement)에 의해 일어나는 거부반응으로 돼지의 혈관세포 표면에 있는 Galα(1,3)Gal 당분자에 인간의 항체가 즉각 반응하기 때문에 일어나며, α1,3-galactosyltransferase(α1,3-GT) 유전자는 돼지 혈관세포 표면의 Galα(1,3)Gal 당분자 생성에 관여한다. 따라서 인간에게 돼지의 장기를 이식하기 위해서는 α1,3-galactosyltransferase 유전자를 제거하는 것이 필요한 것으로 알려져 있다. 본 연구실의 이전 연구에서, 시카고 미니돼지 귀체세포에서 상동 재조합(Homologous recombination)을 통해 α1,3-galactosyltransferase 유전자가 제거된 체세포를 개발한 바 있으며, 이 체세포를 통하여 α1,3-GT 유전자가 제거된 돼지도 생산된 바 있다. 본 연구에서는, human serum 처리 시 돼지 세포를 보호해 준다고 보고되고 있는 human complement regulator인 human Decay-accelerating factor(hDAF)와 human α1,2-fucosyltransferase(hHT)유전자를 α1,3-GT 유전자 위치에 gene targeting하여 동시에 hDAF와 hHT가 발현하는 체세포를 개발하였다. Knock-in vector는 hDAF와 hHT 두 유전자가 발현할 수 있도록 IRES로 연결하였으며, α1,3-GT 유전자의 start codon을 이용하여 발현할 수 있도록 구축하였다. 구축한 vector는 electroporation을 통해 미니돼지 체세포에 도입하였으며, PCR 결과, α1,3-GT 유전자 위치에서 상동 재조합이 일어났음을 확인하였다. Positivenegative 선별 방법을 통해 얻은 gene targeting 된 체세포는 RT-PCR에 의해 hDAF와 hHT 유전자의 발현이 확인되었으며, 대조군(NIH minipig)에 비해 α1,3-GT 유전자의 발현이 감소하였다. 또한 이들 세포에 100% human complement serum을 처리하였을 때 knock-in 세포가 대조군에 비해 30% 정도 더 높은 생존율을 보였다. 따라서 개발된 체세포는 이종간 장기이식을 위한 돼지 생산과 함께 이를 이용한 이종간의 장기 이식 시 초급성 거부반응을 억제하는 데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

본 연구는 돼지 정자의 동결 건조 시 동결 보호제인 trehalose의 효과와 동결 건조 시간과 동결 건조 후 저장 기간에 따라 정자의 생존성과 체외 성숙 난자 내 동결 건조 정자를 직접 주입한 후 전핵 형성율, 난할율 그리고 배발달 성적을 조사하였다. 동결 건조 후 정자의 생존율은 trehalose 무첨가구에 비해 trehalose를 첨가한 처리구에서 높은 생존율을 보였으며, 75 mM의 trehalose를 첨가하여 동결 건조한 정자들의 생존율이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한, 동결 건조 후 저장 기간이 길어질수록 생존율이 낮아지는 경향이었다. 체외 성숙 난자 내 동결 건조 정자를 직접 주입 후 전핵 형성율은 trehalose 첨가구에서 유의적으로 높았으며(p<0.05), 난할율과 배발달 성적도 trehalose 첨가구에서 유의적으로 높았고(p<0.05), 정자의 동결 건조 시간이 짧을수록 높은 난할율과 배발달율을 보였다.

동물의 장기를 인간에게 이식하게 되면 초급성거부반응(Hyperacute rejection, HAR)이 일 어난다. 초급성거부반응은 면역계의 구성요소 중 보체(complement)에 의해 일어나는 거부 반응으로 돼지의 혈관세포 표면에 있는 Galα(1,3)Gal 당분자에 인간의 항체가 즉각 반응하 기 때문에 일어나며, α1,3-galactosyltransferase(α1,3-GT) 유전자는 돼지 혈관세포 표면의 Galα(1,3)Gal 당분자 생성에 관여한다. 따라서 인간에게 돼지의 장기를 이식하기 위해서는 α1,3-galactosyltransferase 유전자를 제거하는 것이 필요한 것으로 알려져 있다. 본 연구 실 의 이전 연구에서, 시카고 미니돼지 귀체세포에서 상동 재조합(Homologous recombination) 을 통해 α1,3-galactosyltransferase 유전자가 제거된 체세포를 개발한 바 있으며, 이 체세 포 를 통하여 α1,3-GT 유전자가 제거된 돼지도 생산된 바 있다. 본 연구에서는, Human serum 처리 시 돼지 세포를 보호해준다고 보고되고 있는 human complement regulator인 human Decay-accelerating factor(hDAF)와 human α1,2-fucosyltransferase(hHT) 유전자를 α1,3 -GT 유전자 위치에 gene targeting하여 동시에 hDAF와 hHT가 발현하는 체세포를 개발하였다. Knock-in vector는 hDAF와 hHT 두 유전자가 발현할 수 있도록 IRES로 연결하였으며 α 1,3-GT 유전자의 start codon을 이용하여 발현할 수 있도록 구축하였다. 구축한 vector는 electroporation을 통해 미니돼지 체세포에 도입하였으며, PCR 결과 α1,3-GT 유전자 위치 에 서 상동 재조합이 일어났음을 확인하였다. Positive-negative 선별 방법을 통해 얻은 gene targeting된 체세포는 RT-PCR에 의해 hDAF와 hHT 유전자의 발현이 확인되었으며, 대조군 (NIH minipig)에 비해 α1,3-GT 유전자의 발현이 감소하였다. 또한, 이들 세포에 100% human complement serum을 처리하였을 때 Knock-in 세포가 대조군에 비해 30% 정도 더 높 은 생존율을 보였다. 따라서 개발된 체세포는 이종간 장기이식을 위한 돼지 생산과 함께 이를 이용한 이종간의 장기 이식 시 초급성 거부반응을 억제하는 데 사용 될 수 있을 것으로 생각된다.

Acyl-CoA synthetase 4(ACSL4) is an arachidonate-preferring enzyme abundant in steroidogenic tissues and postulated to modulate eicosanoid production. The human and mouse ACSL4 gene are mapped on chromosome X. The female mice heterozygous for ACSL4 deficiency became pregnant less frequently and produced small litters, with 40% of embryos surviving gestation. In this study, we examined the regulation of ACS4 by estradiol-17β and progesterone (P4) in the human endometrial cancer cell line HTB-1B. ACSL4 mRNA was increased in a dose-dependent manner. Also, expression of ACSL4 gene was up-regulated in a time-dependent manner in HTB-1B cells. However, combined treatment with progesterone and estradiol-17β modestly decreased the levels of ACS4L mRNA as compared with the estradiol-17β and progesterone respectively. Overall, these results suggest that the ACSL4 gene is regulated by progesterone and estradiol-17β in the HTB-1B cells.

본 연구는 돼지 B-casein 유전자 위치에서 EGFP가 발현될 수 있는 knock-in 벡터를 구축하기 위하여 실시되었다. 돼지의 B-casein 유전자를 이용하여 knock-in 벡터를 구축하기 위해 돼지의 태아 섬유아세포로부터 B-casein 유전자를 동정하였고 EGFP, SV4O polyA signal을 동정하였다. Knock-in 벡터는 5' 상동 영역 약 5 kb와 3' 상동 영역 약 2.7 kb로 구성되어있으며, positive selection marker로 neor 유전자를, negative selection marker로 DT-A 유전자를 사용하였다. 구축된 knock-in 벡터로부터 EGFP의 발현을 확인하기 위하여 생쥐 유선 세포인 HC11 세포에 knock-in 벡터를 도입하였다. 그 결과 EGFP의 발현을 HC11 세포에서 확인하였다. 이와 같은 결과로서 이 block-in 벡터는 knock-in 형질전환 돼지를 생산하는데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

본 연구는 사람 H-transferase가 과발현하는 돼지 체세포주를 개발하는데 있다. 돼지 세포에 사람 H-transferase 유전자를 발현시키는 것은 이종간 장기 이식에 있어서 초급성 거부 반응을 방지하기 위한 한 가지 방법이다. 본 연구에서는 과발현 벡터를 구축하기 위하여 사람 H-transferase을 HepG2 세포로부터 동정하였으며, 이 유전자를 CMV promoter를 이용하여 발현할 수 있도록 포유동물 발현 벡터인 pRc/CMV 벡터에 삽입하였다. 또한, 돼지 산자의 귀 세포를 이용하여 체세포를 수립한 후 jetPEI DNA transfection reagent를 이용하여 벡터를 도입하였고, 300 μg/ml의 G418로 12일간 선별하였다. PCR을 이용하여 선별된 colony들을 분석한 결과, 벡터가 도입되었음을 확인하였고, RT-PCR을 이용하여 사람 H-transferase mRNA가 발현하는 것을 확인하였다. 본 연구에서 확립된 세포주는 사람 H-transferase가 과발현하는 형질 전환 돼지의 생산에 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

체세포의 배양 방법은 체세포 핵이식에 의한 형질 전환 돼지 생산에 있어서 중요한 요인 중 하나이다. 본 연구에서는 돼지 태아 섬유 아세포의 효율적인 배양 방법을 수려하였다. 돼지 태아 섬유 아세포는 임신 33일째 태아로부터 제조하였으며, 돼지 태아 섬유아세포의 증식을 혈청과 배지 종류별로 분석하였다. 그 결과, 15% ES screened FBS가 포함된 DMEM 배지에서의 배양은 15% FBS보다 세포수의 증가가 훨씬 더 빠르게 나타났다. 또한, 태아

본 연구는 효율적인 돼지 난자의 활성화를 통한 수핵란의 대량 확보를 위하여 ethanol, Ca-ionophore 및 strontium의 최적 농도 및 노출 시간을 규명하기 위하여 실시되었다. Ethanol은 10%에서 10분간 노출시켰을 때 난할율과 배발달 성적이 각각 51.4%와 45%로 다른 처리구에 비하여 유의적으로 높았으며 (P<0.05), Ca-ionophore는 에서 2분간 노출시켰을 때 난할율과 배발달 성적이 유의적으로 높았다. 또한 st

본 연구는 ICSI후 돼지 난자의 활성화 처리와 ICSI전 주입정자의 수정 능력 획득 유기효과를 구명하기 위하여 실시하였다. ICSI후 ethanol, cycloheximide 그리고 ethanol과 cycloheximide를 병용처리 시 난할율과 배반포배 발달율이 대조구와 처리 구간에 유의적인 차이가 없었다(p<0.05). 그러나 ICSI전 caffeine과 Ca-ionpphre로 주입정자의 수정능력 획득 유기 처리 시 난할율과 배반포배발달율 모두 처

다양한 발정유기 방법의 반복처리에 따른 분만율은 평균 로 나타났고 생시체중에 있어서 자연 발정구와 발정 유기구에서 차이를 거의 보이지 않았으며 송아지 육성율은 농가의 사육경험이 많을수록 우수한 경향이었고 발정 동기화의 반복처리가 차기번식에 미치는 영향은 확인할 수 없었다. 1. 발정 유기구와 자연 발정구에서 출생한 송아지의 생시체중은 암송아지에서 각각 23.9kg, 24.0kg이었고, 수송아지에서 26.2kg, 24.9kg로써 처리간 차이가 없었다. 2

저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 5(LRP5)는 간과 췌장을 포함하여 많은 조직에서 발현하며 아포리포단백질 E와 결합한다. 이와 같은 LRP5 유전자의 체내 기능을 규명하기 위하여 LRP5 유전자가 결손된 생쥐를 개발하였다. 먼지 LRP5 genomic DNA는 TT2 ES 세포로부터 분리하였으며 LRP5 유전자의 엑손 18에 neo 유전자를 삽입한 vector를 구축하고 TT2 ES 세포에 도입하였다. 178개의 G418 내성을 보인 세포 중 상동유전자 재조합에 의하여 targeting vector가 LRP5 유전자 위치에 삽입된 clone은 3개였다. 키메라 생쥐는 상실배기 수정을 ES 세포와 응집시켜 생산하였으며 생산된 키메라 생쥐는 C57BL/6 생쥐와 교미를 유도하여 heterozygous를 얻었다. 또한 이들 heterozygous간의 교배에 의하여 LRP5 유전자 결손 생쥐를 생산하였다. 이러한 생쥐는 LRP5 유전자의 체내 기능연구에 있어서 모델로 이용될 것으로 생각된다.