본 연구는 핵산가수분해 기능이 있는 항체인 3D8 scFv(single-chain variable fragment) 유전자를 형질전환 닭에서 발현시키고 3D8 scFv 항체의 항-바이러스 기능을 검증하고자 한다. 연구는 in vitro(형질전환 닭유래 세포)와 in vivo(형질전환 닭)로 나누어서 수행하고자 한다. 먼저 닭 태아섬유아세포는 형질전환 닭과 일반 닭을 각각 인공수정을 시킨 후 생산된 10일차 수정란의 태아에서 CEF(Chicken Embryo Fibroblast)를 수집하였다. 3D8 scFv 유전 자가 삽입된 CEF 세포는 항생제(puromycin)를 이용하여 형질전환 세포만을 선발하였다. 그 리고 선발된 CEF 세포는 면역염색을 이용하여 3D8 scFv 유전자가 세포내에서 단백질로 발현됨을 확인하였다. 그리고 선발된 세포들의 항-바이러스 기능 검증은 GFP 유전자로 표 지된 재조합 NDV(Newcastle Disease Virus)를 세포에 직접 감염시키고, 세포내에서 발현 하 는 GFP의 발현량을 FACS를 이용하여 정량하는 방법으로 항-바이러스 기능을 조사하였다. 이들 가운데 항-바이러스 기능이 있을 것으로 예상되는 형질전환 2계통에 대하여 항-바이러스 기능을 검증을 준비하고 있다.

We report here the production of transgenic chickens that can regulate human erythropoietin (hEPO) gene expression. The glycoprotein hormone hEPO is an essential for viability and growth of the erythrocytic progenitors. Retrovirus vector system used in this study has two features including tetracycline-controllable promoter and woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulator element (WPRE). The former is for to reduce the possibility of physiological disturbance due to constitutional and unregulated expression of hEPO gene in the transgenic chicken. The latter is for maximum expression of the foreign gene when we turn-on the gene expression. A replication-defective Moloney murine leukemia virus (MoMLV)-based vectors packaged with vesicular stomatitis virus G glycoprotein (VSV-G) was injected beneath the blastoderm of non-incubated chicken embryos (stage X). Out of 325 injected eggs, 28 chicks hatched after 21 days of incubation and 16 hatched chicks were found to express the hEPO gene delivered by the vector. The biological activity of the recombinant hEPO in transgenic chicken serum was comparable to its commercially available counterpart. The recombinant hEPO in transgenic chicken serum had N- and O-linked carbohydrate simillar to that produced from in vitro cultured cells transformed with hEPO gene.

본 연구는 vesicular stomatitis virus G glycoprotein (VSV-G)으로 피막이 형성되는 replication-defective MoMLV-based vector를 이용한 hTPO 헝질전환 닭의 생산에 관한 연구이다. 실험에 사용한 retrovirus vector의 구조는 hTPO 유전자의 발현 조절을 위해 internal promoter인 hCMV promoter를 이용하였으며 외래 유전자의 발현을 증가시키기 위해 woodchurk hepatitis virus posttranascriptional regulatory element (WPRE) 서열을 도입하였다. 재조합한 vector는 GP2 293 포장세포에 도입하여 virus를 생산하였으며 이 virus를 이용하여 감염시킨 여러 표적세포에서 hTPO의 발현과 생물학적 활성을 확인하였다. 재조합 hTPO의 생물학적 활성은 시판되고 있는 재조합 hTPO에 비해 우월한 것으로 확인되었다. hTPO 형질전환 닭의 생산을 위하여 1,000배 이상 고농도로 농축된 virus를 stage X 단계의 계란의 배반엽 층에 미세주입하여 대리난각 방법으로 배양하였다. 미세주입한 132개의 계란 중 21일 후에 11개의 계란에서 병아리가 부화하였으며 그중 4마리가 형질전환 개체로 확인되었다. 그러나 생산된 4마리 중 3마리가 부화 후 1개월 이내에 원인불명으로 사망하였다. 본 연구의 의의는 상업적 이용 가능성이 있는 생물학적 활성을 가진 사람의 cytokine 단백질의 대량 생산을 위한 생체 반응기로서의 형질전환 닭 개발의 시례를 제공하는데 있다.

hFSH는 α와 β subunit으로 구성된 heterodimer로서 두 subunit의 조합은 활성을 지닌 호르몬의 생산에 있어서 매우 중요한 단계이다. 이 조합과정의 효율을 증대하기 위하여 본 연구에서는 hFSH를 단일사슬의 단백질로 구축하고자 하였으며, 이의 일환으로 각 subunit 대한 cDNA단편을 연결하는 서열로 CTP linker를 도입하였다. 재조합한 hFSH-CTP 유전자는 pseudotype의 retrovirus vector system을 이용하여 CHO 세포와 닭의 배로 각각 전이되었다. CHO 세포에서의 FSH의 생산은 α와 β를 각각 전이한 경우에 비해 hFSH-CTP를 전이한 경우에서 17배 이상 높은 것으로 나타났다. 닭에서는 유전자 전이를 시도한 62개체 중에서 11마리가 부화하였으며 그 중 10마리가 형질전환된 닭인 것으로 RT-PCR을 통하여 확인되었다. 그러나 개체의 혈중 FSH의 생산은 확인하지 못하였다. 이상의 실험 결과를 바탕으로 하여 재조합된 hFSH-CTP는 FSH의 발현에 매우 효율적인 구조로 생각되며, 또한 retrovirus를 이용한 유전자 전이 방법은 형질전환 가금의 생산에 있어서 매우 적절한 방법으로 사료된다.

조류는 발생학적 특성상 수정과 초기 배발생을 제외한 거의 대부분의 개체발생 과정이 난각 속에서 진행된다. 그러므로 수정란에 생명 공학적 기법을 적용하는데 있어서, 포유류의 경우 여러 생명공학 기법이 적용된 수정란은 초기발생을 위한 체외배양 이후 반드시 모체에 이식되어야 하지만, 조류의 경우 인공적인 체외배양 체계가 확립되어 있어야 생명공학 기법이 적용된 수정란을 개체까지 발생시킬 수 있게 된다. 닭의 난자는 난관 누두부에 배란 후 약 15분내에 정자의 침입을 받아 수정되어 난관 팽대부에 도달하면 1세포기 수정란이 된다. 그 후 수정란이 협부에 도달하면 최초로 분할이 일어나기 시작하여, 방란시에는 그 세포수가 60,000개에 이르게 된다. 한편, 계란의 형성 과정에서는 다량의 난황을 포함한 난자가 난관 누두부로 배란되어 정자와 만나게 되면 수정란으로서 계란 형성이 계속되고 정자와 만나지 못하게 되면 무정란으로서 계란 형성을 계속하게된다. 배란된 난자가 난관누두부를 거쳐 난관팽대부에 도달되면 난자는 농후난백에 의해 둘러싸이게 되고 난관혈부에 도달되면 난각막이 형성되고 수양성 난백이 침적하게 된다. 그 후, 난관협부를 지난 난자는 난관자궁부에 도달되면 20시간이상 그곳에 머물면서 난각형성이 진행된 다음 방란된다. 따라서 수정란에 외래유전자를 미세주입하여 형질전환 닭을 생산하기 위해서는 수정란을 암탉의 난관 내에서 최초 분할되기 전에 외부로 끄집어내어야 하며, 수정란에 외래 유전자를 미세주입한 다음에는 다시 암탉의 난관내로 이식해야 하지만 현재까지 그러한 기술은 확립되어 있지 못하다. 그렇기 때문에 모체의 난관 속에서 일어나는 배 발생과 그 이후 개체까지의 발생을 위하여 인공적인 체외배양 체계가 확립되어 있어야 한다. 따라서 본 발표에서는 형질전환 닭을 생산하기 위한 양질의 1세포기 수정란 획득 방법과 획득된 수정란의 체외 배양방법에 관하여 기술적인 측면에서 고찰 해보고자 하며, 그와 같은 배양 기술을 이용하여 외래유전자를 도입한 일련의 결과에 관하여 보고 하고자한다.

형질전환 동물은 질병의 모델, 유전자 기능 및 조절에 관한 연구, 또는 독성물질을 탐색하는 연구 수단 등과 같은 기초 연구 분야뿐만 아니라 인체에 유용한 단백질의약품의 생산과 간, 신장 등 특정 장기의 공급원 등과 같은 임상적인 분야에서도 활용가치가 매우 크다. 이 중 형질전환 동물을 이용한 치료용 단백질의 생산은 비교적 낮은 생산 원가와, 분리와 정제의 용이성, 그리고 효율적인 대량 생산 체계의 확립 등의 장점을 가진다. 형질전환동물을 바이오의약품 생산수단으로 사용하고자 하는 발명에는 젖, 소변 또는 혈액을 통하여 백혈구증식인자, 조혈인자, 항체 등 고가의 생물의 약품을 배출시키는 소, 돼지, 흑염소 등이 등록되어 있다. 이 방법은 기존의 세포배양 방법보다 생산비용이 훨씬 저렴하고 부가가치도 높아 새로운 의약품 생산수단으로 주목받고 있다. 그러나 현재까지 방대한 시간과 비용이 투자되었음에도 불구하고 형질전환 가축을 이용한 바이오 의약품의 경제적인 성공사례는 매우 미미하며, 그 근본 원인은 대부분 포유류들의 긴 세대 간격, 천문학적인 비용과 많은 시간, 그리고 외래 단백질이 체내에서 과잉 발현됨으로 인해 발생하는 형질전환동물의 생리적인 부작용에 있다고 요약할 수 있다. 생체반응기로서 가금이 포유동물에 비해 갖는 장점은 첫째, 성성숙기간과 세대간격이 짧으며, 둘째, 포유류에 비해 번식능력이 대단히 높기 때문에(연간 300개 이상의 계란을 생산) 형질전환된 가금의 계통성립이 용이하고, 셋째, 비교적 적은 노력과 비용으로 많은 개체를 대상으로 하는 실험이 가능하다는데 있다. 또한 각 계란의 난백에는 총 3 g 정도의 단백질 성분이 있으며 단백질의 종류는 8가지 뿐이다. 따라서 형질전환 포유동물의 젖에 비하여 형질전환 닭의 계란에 함유된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 것이 훨씬 용이하다. 예를 들면, 현재 난백으로부터 특정 단백질을 분리하는 비용이 g당 10달러 정도로 추산되는데, 이는 세포배양액으로부터 특정 단백질을 분리하는 비용의 1%에 불과하다. 따라서 형질전환 닭의 생산은 기초적인 연구로서도 중요할 뿐만 아니라 계란을 이용한 치료용 단백질의 대량 생산에 있어서도 그 의미가 크다. 닭은 번식생리학적으로 포유동물과 매우 달라 기존의 포유동물 형질전환 방법을 동일하게 적용할 수는 없으며, 형태적, 발생학적 차이점을 고려하여 발전된 형질전환 닭의 생산방법에는 유전자를 전달받는 표적세포와 유전자전이 방법에 따라 다양한 방법이 이용되고 있다. 형질전환 닭의 생산을 위한 표적세포로는 stage X의 배반엽세포(갓 산란된 유정란의 배를 구성하는 세포), 원시생식세포(primordial germ cell), 닭의 난관에서 채집한 1세포기의 수정란 그리고 정자 등이 있다. 표적세포에 대한 유전자 전이 방법에는 물리화학적 DNA 전이 방법과 retrovirus (lentivirus) vector system을 이용한 방법으로 크게 나눌 수 있다. 각각의 방법은 외래 유전자의 전이 효율이나 다음 세대로의 전달 여부, 그리고 기술적인 용이성에서 조금씩의 차이를 나타내는데, 이 중 다음 세대로의 유전자 전달이 잘 이루어지고 기술적인 용이성이 높은 관계로 현재 가장 널리 사용되고 있는 방법은 배반엽세포 및 원시생식세포를 표적세포로 virus vector system을 이용하여 유전자를 전이하는 방법이다. 기존의 다른 유전자 전이 체계와 비교해 볼 때, 레트로바이러스를 이용한 유전자 전이는 기술적인 용이성과 효율적인 발현, 그리고 전달된 유전자의 유전적인 안정성 등의 장점을 나타낸다. 기존의 retrovirus vector에서는 주로 LTR이나 β-actin, CMV promoter 등과 같은 constitutive promoter를 이용한 외래 유전자의 발현은 개체 전체에 걸쳐 광범위하게 이루어지므로 형질전환 동물의 생리적인 부작용을 나타내는 경우가 많았다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 외래 유전자의 발현으로 인한 생리적인 부작용을 최소화하면서 또한 특정 조직에 국한하여 일어날 수 있도록 조직 특이적 발현 promoter와 유전자의 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 promoter 등을 개발하기 위한 노력이 시급한 실정이다. 예를 들면, 닭의 난관에서 특이적으로 발현하는 ovalbumin promoter와 tetracycline inducible promoter 등이 그것이다. 또한, 필요한 경우에는 동물체에 도입된 외래 유전자의 발현을 최대화하기 위하여 WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)와 같은 서열도 도입되어야 할 것이다. 본 연구자들은 retrovirus vector system을 이용하여 닭의 배반엽세포에 외래유전자를 전이하는 방법으로 형질전환 닭을 생산하는 연구를 진행하고 있으며, 선행된 연구 결과에 의하면 전이된 외부 유전자가 닭의 genome 상에 삽입되어 발현되는 것을 생산된 모든 병아리에서 확인할 수 있었다. 따라서 생체반응기로서 일반 포유류가축 대신 닭을 사용하는 것이 앞에서 언급한 시간적, 경제적 장점 외에 형질전환개체의 생산 측면에서의 성공 가능성이 훨씬 높다고 단언할 수 있다. 본 연구자는 외래 유전자의 발현율을 증가시키기 위하여 retrovirus vector에 WPRE 서열을 도입하였으며, 외래 유전자의 과잉 발현에 의한 개체의 생리적인 부작용을 최소화하기 위하여 외래 유전자의 발현에 대한 개시 및 종료가 조절 가능한 tetracycline inducible expression system을 도입하여 형질전환 닭을 생산하였다. 현재까지 형질전환 닭으로부터 발현을 시도한 재조합 단백질로는 단일클론항체, FSH, EPO, G-CSF 그리고 interferon 등이 있으며, 이들 단백질이 산란된 계란의 흰자에 분비되도록 하는 기술을 개발하여 실용화하려는 시도를 하고 있다. 그러나 현재까지 개발된 형질전환 닭의 생산에 있어서 매우 만족할 만한 성공적인 사례는 거의 전무한 실정이며, 이에 생체반응기로서의 형질전환 닭의 생산에 관한 연구가 적극적으로 진행되어야 할 것으로 생각된다.