Tannic acid가 파밤나방의 중장액에 존재하는 단백질분해효소의 활성을 저해함으로 처리된 Bacillus thuringiensis(이하 B. thuringiensis) subsp. kurstaki KB100균주의 insecticidal crystal proteins(ICPs)의 과분해를 억제하며 살충활성을 상승시키는 효과가 있다는 연구결과를 기초로, tannic acid의 protease inhibition여부 및 tannic acid가 B. thuringiensis KB100균주의 parasporal inclusion에 미치는 영향을 조사하였다. Tannic acid와 파밤나방 중장액을 먼저 혼합하여 반응시킨 후 B. thuringiensis KB100의 parasporal inclusion에 처리하여 SDS-PAGE를 통해 단백질밴드를 확인한 결과, 중장액내의 단백질분해효소에 의해 정상적으로 분해되어 60KDa의 살충활성을 나타내는 독소단백질 밴드를 나타냈다. 따라서 tannic acid에 의한 살충활성증대의 정확한 영향을 확인하기 위해, B. thuringiensis의 parasporal inclusion과 먼저 혼합하여 반응시킨 후 파밤나방 중장액을 처리하고 단백질 밴드패턴을 확인한 결과 전독소인 130kDa의 단백질이 거의 분해되지 않고 나타났다. B. thuringiensis KB100의 parasporal inclusion과 tannic acid을 먼저 혼합하여 반응시킨 것을 위상차현미경하에서 확인한 결과, tannic acid의 농도가 높아질수록 parasporal inclusion이 응집하여 있는 것이 확인되어, tannic acid가 파밤나방 중장 내 소화효소에 반응하는 영향보다 B. thuringiensis 독소단백질의 응집을 통해 소화효소의 분해저해 원인 가능성을 확인하였다.

Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki KB100 isolated from the domestic soil have the most effective activity against the beet armyworm, Spodoptera exigua larva. The tannic acid as protease inhibitor might be increased the efficacy of sublethal concentrations of B. thuringiensis. The tannic acid was identified as a protease inhibitor that could increased the efficacy of sublethal concentrations of B. thuringiensis. Mixture of B. thuringiensis and tannic acid was investigated the mortality of S. exigua larva in the laboratory and field. When B. thuringiensis treated to 2nd larva of S. exigua, mortality was shown 54.4%. However, mixtures of B. thuringiensis with 4 and 40 mM tannic acid were increased mortalities to 2nd larva of S. exigua as 64.0 and 95.5%, respectively. Also, synergy effect of mixture of B. thuringiensis and 40 mM tannic acid was increased the mortality of S. exigua 3rd larva to 93.3%, even though 60.0% mortality with only B. thuringiensis treatment. On the other hand, the mortality of mixture with B. thuringiensis and 80 mM tannic acid was 53.3% lower than B. thuringiensis single treatment. In the welsh onion field, the accumulated mortalities of 3 times replicated with mixture of B. thuringiensis and 40 mM tannic acid were 83.9, 89.4 and 66.8% compare with 61.8, 80.4 and 47.3% as only B. thuringiensis treatment, respectively.

파밤나방은 파, 배추, 수박 등에 다 발생하여 큰 피해를 주는 대표적인 농업 해충이며 화학농약에 대한 저항성이 강한 대표적인 해충으로, 본 연구에서는 생물적 방제인자로 방제하고자 Bacillus thuringiensis(이하 Bt) 균주를 선발하여 살충효과를 검정 하였다. 파밤나방의 살충효과검정에서 내성이 강한 해충과 비슷한 양상으로, 나비목 해충과 다르게 Bt에 대한 살충활성이 늦게 나타나는 지효성을 나타냈다. 이러한 원인으로 유충 중장 프로테아제에 의해 Bt의 cry 독소가 과분해 되는 것으로 가정하고 protein inhibitor로 알려져 있는 tannic acid를 선발하여 실내 실험과 야외 포장 실험을 수행하였다. 그 결과 Bt 단독처리보다 Bt와 tannic acid를 혼합처리 했을 때 더 높은 사충율을 나타냈다. 이 같은 결과에 대해 원인을 규명하고자, 가설을 세워 실험을 수행 하였다. 중장 프로테아제가 130kDa의 불활성 독소를 60kDa의 활성 독소로 분해한 후, 더 과분해 하는 것을 tannic acid가 억제할 것이다 라고 가설을 세운 후 실험을 수행 하였다. SDS-PAGE를 하여 tannic acid의 억제정도를 확인했고, 이 결과를 토대로 40mM tannic acid를 전 처리 한 후 Bt처리를 한 결과 동시처리보다 약 5% 더 높은 사충율을 나타냈다. Bt와 중장 프로테아제, tannic acid의 반응에 있어서 형태적인 면을 확인하기 위해 전자현미경을 관찰 하였다. 중장 프로테아제의 증명을 위해 자이모그램 실험을 수행 하였다.

Bacillus thuringiensis, an entomopathogenic bacterium belonging to the B. cereus group, harbors numerous extra-chromosomal DNA molecules whose sizes range from 2 to 250 kb. In this study, we used a plasmid capture system (PCS) to clone three small plasmids from B. thuringiensis subsp. kurstaki K1 using PCS which were not found in B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, and determined the complete nucleotide sequence of plasmid pK1S-1 (5.5 kb). Of the six putative open reading frames (ORF2-ORF7) in pK1S-1, ORF2 (MobK1) showed approximately 90% aa identity with the Mob-proteins of pGI2 and pTX14-2, which are rolling circle replicating group VII (RCR group VII) plasmids from B. thuringiensis. In addition, a putative origin of transfer (oriT) showed 95.8% identity with those of pGI2 and pTX14-2. ORF3 (RepK1) showed relatively low aa identity (17.8-25.2%) with the Rep protein coded by RCR plasmids, however. The putative double-strand origin of replication (dso) and single-strand origin of replication (sso) of pK1S-1 exhibited approximately 70% and 64% identities with those of pGI2 and pTX14-2. ORF6 and 7 showed greater than 50% similarities with alkaline serine protease, which belongs to the subtilase family. The other 2 ORFs were identified as hypothetical proteins. To determine the replicon of pK1S-1, seven subclones were contructed in the B. t huringiensis ori-negative pHT1K vector and were electroporated into a plasmid cured B. thuringiensis strain. The 1.6 kb region that included the putative ORF3 (Rep1K), dso and ORF4, exhibited replication ability. These findings identified pK1S-1 as a new RCR group VII plasmid, and determined its replication region.

파밤나방은 파, 배추, 수박 등에 다발생하여 큰 피해를 주는 대표적인 농업 해충이며 화학농약에 대한 저항성이 강한 대표적인 해충으로, 본 연구에서는 생물적 방제인자로 방제하고자 Bacillus thuringiensis(이하 Bt) 균주를 선발하여 살충효과를 검정 하였다. 파밤나방은 살충효과검정과정에서 내성이 강한 해충과 비슷한 양상으로, 다른 나비목 해충과 다르게 Bt에 대한 살충활성이 늦게 나타나는 지효성을 나타냈다. 이러한 원인으로 유충 중장의 프로테아제에 의해 cry 독소가 과분 해 되는 것으로 가정하고 protein inhibitor로 알려져 있는 tannic acid를 선발하 여 실내 실험과 야외 포장 실험을 수행하였다. 그 결과 Bt 단독처리보다 Bt와 tannic acid를 혼합처리 했을 때 더 높은 사충율을 나타냈다. 이 같은 결과에 대해 원인을 규명하고자, 몇 가지 가설을 세워 실험을 수행 하였다. 첫 번째 tannic acid가 Bt균 자체에 영향을 미치는 영향을 확인 하기 위해, Nutrient Agar(NA)배지에 tannic acid를 처리했을 때, Bt균의 생장여부와 생장정도를 확 인하고, 중장액과 Bt, tannaic acid를 각각 또는 혼합처리 했을 때의 중장내 Bt crystal의 형태적 변화를 관찰하기 위해 주사전자현미경 관찰을 수행 하였다. 두 번째로 중장 프로테아제가 130kDa의 불활성 독소를 60kDa의 활성독소로 분해한 후, 더 과분해 하는 것을 tannic acid가 억제할 것이라는 가설을 증명하 기 위해 SDS-PAGE를 수행하여 tannic acid의 억제정도를 확인했고, 이 결과를 토대로 40mM tannic acid를 전처리 한 후 Bt처리를 했을 때, 동시처리보다 약 5% 더 높은 사충율을 나타냈다.

벼에 발생하여 엽육을 전체적으로 식해해서 피해를 주는 혹명나방(Cnaphalocrosis medinalis)과 벼애나방(Naranga aenescens)의 곤충병원성미생물을 이용한 친환경적 방제를 위해, 국내 논토양에서 분리된 Bacillus thuringiensis 중에서 위 두 종 해충 모두에 높은 살충효과를 보이는 균주를 선발하였다. 선발된 HARI004균주는 혹명나방, 벼애나방 두 종 모두에 1차생물검정에서 90%이상의 살충율을 나타내며 높은 살충활성을 보였으며, 실내에서 방제실험을 수행한 결과, 포자 및 크리스탈 현탁액을 처리한 후 3일째부터 무처리구와 유충에 의한 피해엽수에 차이를 보이며 살충효과가 나타나기 시작하여 피해엽비율을 약 58%이상 줄이며 방제효과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 또한 SDS-PAGE를 통한 HARI004균주의 내독소단백질의 패턴을 분석한 결과, B. thuringiensis subsp. kurstaki와 유사한 주요 단백질 밴드를 확인할 수 있었으나, 혈청학적인 분류를 통해 정확하게 동정해야 할 것으로 보인다.

Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1으로부터 생산된 살충성 내독소 단백질을 coding하는 CryIIA 유전자를 클로닝하고 염기서열을 조사하였다. HD-1 균주의 12개 plasmid 중 225kb plasmid를 분리하여 CryIIA 유전자를 포함하는 5kb HindIII 절편을 hybridization하여 찾아냈다. 이 절편을 plasmid pUC19에 ligation하여 E. coli에 형질 전환하였다. 이 독소 유전자를 포함하는 4kb BamHI-HindIII 절편은 vector pT7-5에 ligation하여 pSKIIA라하였다. pSKIIA는 3개의 open reading frames(orf1, orf2, orf3)로 구성되어 있으며 염기서열은 3,952base로 되어 있었다. 이러한 3개의 orf 각각의 발현 여부를 확인하기 위하여 생물검정을 하였다. 그러나 orf1 또는 orf2에 의한 형질 전환체는 독성이 없는 것으로 나타났다. orf3를 포함하는 형질 전환체는 3종의 나비목 곤충(배추점나방, 담배거세미나방, 담배나방) 및 1종의 파리목 곤충(집모기) 유충에 대하여 독성을 나타내었다.

B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1을 아밀라제 생산배지에 32℃로 24시간 배양하였을 때 아밀라제 활성은 0.40 units/ml 였고, 50mM EDTA에 의하여 활성이 억제되었으며, 기본배지에 soluble starch와 Ca2+, Mg2+, Mn2+을 첨가했을 때 활성이 비교적 높았고, pH6.5와 7.0 사이에서, 온도 55℃에서 비교적 활성이 높았다. 아밀라제 생산을 위한 최적 배지로는 0.2% soluble starch, 1.0% bacto-peptone, 0.3% beef extract, 0.5% NaCl, 0.3% K2-KH2PO4, 0.012% CaCl.2H2O, 0.005% MnSO4.H2O, 0.03% MgSO4.7H2O이었다. 효소 용액을 에 HPO4, 0.1% 탄올 침전시켜 5ml의 0.1M 인산염 완충액에 용해한 용액의 비활성은 2.01 units/mg였고, starch에 대한 효소의 Km 값은 0.80 mg/ml였다.