본 연구에서는 수산물 시료 중 Salmonella spp. 검출을 위해 단시간의 전배양(2시간 이내)과 탈염과정을 포함한 DNA 추출법을 사용하여 분자생물학적 검출을 위한 수산 물 전처리 방법에 대해 연구하였다. 배양 시간에 따른 증 균 효율을 탐색하기 위해 100, 101 및 102 CFU/mL농도 의 Salmonella spp. 5종을 NB 0.5에 접종하여 증균 전, 1시간 및 2시간 동안의 증균 효율을 비교하였다. 그 결 과, 2시간 동안 모든 농도에서 약 1 log CFU/mL가 증균 되어 초기 농도와 유의적인 차이가 나타났다. 또한 지역 별 패류시료에 S. Typhimurium을 인위적으로 감염시킨 뒤 DNA를 추출하여 염농도를 측정한 결과, 모든 시료의 염농도가 0%로 DNA 추출과 동시에 탈염이 이루어진 것 을 확인하였다. 이후 추출한 DNA를 사용하여 PCR을 수 행한 결과 모든 시료에서 S. Typhimurium의 특이적 양성 밴드가 확인되었다. 다음으로 수산물 시료 중 Salmonella spp. 검출을 위한 증균 과정과 탈염을 포함한 DNA 추출 방법의 검증을 위해 멸균 홍합시료 및 비멸균 홍합시료 에 Salmonella spp. 5종을 인공적으로 약 100, 101, 102 CFU/g의 농도로 오염시켜 전배양과 DNA를 추출하여 PCR로 특이적 증폭 밴드의 여부를 확인한 결과, 모든 농 도의 Salmonella spp. 5종에서 특이적 밴드가 확인되었다 . 결과적으로 본 연구에서 제시한 전배양 및 DNA 추출 방법을 포함한 전처리 방법과 PCR을 사용하여 수산물 시 료에서 10 CFU/g 미만의 Salmonella spp.를 검출하였으 며, 시간과 비용면에서 효율적이며 과정이 복잡하기 않기 때문에 수산물의 처리 현장에 활용될 수 있을 것으로 기 대된다.

메타바코딩을 이용한 환경 DNA 분석은 검출 감도가 높아 어류의 생물다양성 평가 및 멸종위기종의 검출에 유용 한 기술이다. 이번 연구는 메타바코딩을 이용해 우리나라 담수어류를 대상으로 높은 검출 효율을 보일 수 있는 적합 한 분석방법을 확인하기 위해 4가지 분석조건별, 즉 필터 (cellulose nitrate filter, glass fiber filter), 추출 키트 (DNeasy® Blood & Tissue Kit, DNeasy® PowerWater Kit), 프라이머 조합 (12S rDNA, 16S rDNA) 그리고 PCR 방법 (conventional PCR, touchdown PCR)로 나타나는 Operational Taxonomic Units (OTUs) 수와 종 조성을 비교하였다. Glass fiber filter와 DNeasy® Tissue & Blood Kit를 이용해 추출한 시료는 12S rDNA와 16S rDNA 프라이머 조합에서 담수어류 OTUs가 가장 많이 검출되었다. 모든 분석조건 중 프라이머 조합에서만 조기어강 (Class Actinopterygii) 평균 OTUs 수에서 통계적으로 유의한 차이를 보였고 (Non-parametric Wilcoxon Signed Ranks Test, p=0.005), 담수어류 평균 OTUs 수는 유의하지 않았다. 종 조성 비교 결과 역시 프라이머 조합에서 유의한 차이를 보였고 (PERMANOVA, Pseudo-F=6.9489, p=0.006), 나머지 분석조건에서는 유의한 차이를 보이지 않았다. NMDS 분석 결과 종 조성은 유사도 65% 기준에서 프라이머 조합에 따라 묶였고, 16S rDNA 프라이머 세트는 주로 멸종위기종인 모래주사 (Microphysogobio koreensis), 꼬치동자개 (Pseudogobio brevicorpus)가 기여하였고, 12S rDNA 프라이머 세트는 주로 일반종인 피라미 (Zacco platypus), 꺽지 (Coreoperca herzi) 등이 기여한 것으로 나타났다. 본 연구는 국내 하천에서 채취한 시료에 대한 메타바코딩을 이용한 종 다양성 분석의 기초정보를 제공한다.

환경유전자 (eDNA)는 다양한 환경 (수중, 토양, 대기)에 존재하는 생물체로부터 유래된 유전물질을 의미한다. eDNA는 높은 민감도, 짧은 조사시간 등 많은 장점들이 존재하며 이로 인해 생물 모니터링 및 유해생물과 멸종위기 생물을 탐색하는 분야에 다양하게 활용되고 있다. 이러한 eDNA 를 채집하기 위해서는 대상생물 및 대상유전자뿐만 아니라 현장 여과방법 및 eDNA 보존방법과 같이 매우 다양한 항목들을 고려해야 한다. 특히 환경에서 eDNA를 채집하는 방법은 eDNA 농도와 직결되는 항목으로서 적절한 채집방법을 사용하여 eDNA를 채집할 때 정확한 분석결과를 얻을 수 있다. 또한 현장에서 채집한 eDNA를 보존하고 추출하는 과정에서도 정확한 방법을 사용하였을 때 현장에 분포하는 eDNA의 농도를 정확하게 파악할 수 있다. 특히 eDNA 연구를 시작하는 연구자들에게 eDNA 분야는 초기 진입 장벽이 매우 높은 기술로서 이를 위한 기초 자료가 매우 절실하다. 본 연구에서는 본 연구는 eDNA가 수생태계를 연구하기 위한 도구로서 보다 널리 이용되며, eDNA를 이용하기 시작하는 연구자들에게 도움을 주고자 수생태계에서 eDNA를 채집하고 및 운반하는 방법과 실험실에서 eDNA를 추출하는 방법을 소개하고, 보다 간편하고 효율적인 eDNA 채집 도구와 방법을 제시하였다.

기존의 L. monocytogenes 증균배지를 개량함으로써 증균배지를 개발하여 L. monocytogenes의 증균 효율을 높이며, DNA 추출에 사용되는 용해버퍼 및 용해조건을 개발함으로써 식육 및 식육가공품에서 L. monocytogenes를 효 율적이고 신속하게 검출하고자 하였다. 식품공전에 등재 되어 있는 L. monocytogenes 증균배지의 증균 효율을 비 교하였으며, Listeria Enrichment Broth (LEB)가 가장 우수한 증균 효율을 보였다. LEB에 탄소원, 질소원, 미네랄 등 다양한 성분을 첨가하여 증균배지를 개발하였으며, 그 결과 LEB에 0.1% pyruvate, 0.1% ferric citrate를 첨가한 개발 증균배지에서 L. monocytogenes가 가장 빠르게 증균되었다. L. monocytogenes의 DNA를 신속하고 효율적으로 추출하기 위해 용해버퍼와 용해조건을 개발하였으며, 그 결과 0.5% 또는 1% N-lauroylsarcosine sodium salt에 0.5 N NaOH와 0.5 M EDTA가 혼합된 용해버퍼를 이용하여 실온에서 30분 간 L. monocytogenes 세포를 용해시키는 것 이 DNA의 순도와 수율, 신규성과 경제적 측면에서 가장 우수한 것으로 확인되었다. 결론적으로 본 연구에서 개발 된 증균배지 및 DNA 추출법을 활용한다면 식육 및 식육 가공품에서 L. monocytogenes를 보다 신속하게 검출할 수 있을 것이다.

본 연구에서는 가축분퇴비에 존재할 수 있는 식중독균 의 검출을 위하여 기존의 배양을 이용한 방법을 대체할 수 있는 real-time PCR을 적용하고자 하였으며, 이에 따라 유전자 증폭에 영향을 미치는 DNA 추출 방법에 따른 식중독균 검출 효율을 비교하였다. 적용한 방법은 가열 처리, 유기용매 및 흡착제 처리, 효소 처리의 3가지로 구분 할 수 있으며, 각 방법에 따른 DNA의 검출 효율을 실험 결과로 나타내었다. 가열 처리 방법에서는 가열 시간의 증가에 따라 DNA 검출 효율이 높아지는 경향을 나타냈으며, 유기용매 및 흡착제는 효과를 나타내지 않았고, 효소 처리의 경우에는 그람 양성균 보다는 그람 음성균의 DNA가 추출 효율이 더 높은 것으로 나타났다. 결론적으로 퇴비에서 30분 이상의 가열 처리와 효소의 처리를 통한 DNA 추출 방법은 real-time PCR을 적용한 식중독균 검출에 적합한 것으로 판단된다.

유전분석을 위해서, CTAB buffer를 이용하여 가시나무류 4종의 genomic DNA를 분리하였다. CTAB buffer를 이용하여 분리한 genomic DNA의 순도는 Edward buffer를 이용했을 때보다 더 높게 나타났다. 가시나무(Q. myrsinaefolia)로부터적정 순도 gDNA는 2% CTAB에 0, 1 또는 2% PVP가 첨가된 buffer를 이용했을 때 얻어졌다. 종가시나무(Q. glauca)로부터 1% CTAB buffer와 1% PVP를 첨가한 buffer를 이 용하여 얻은 gDNA 순도는 1.84±0.02(A260/280)였다. 참가시나무(Q. salicina)의 적정순도 gDNA는 2% CTAB와 1 또는 5% PVP가 첨가된 buffer를 이용하여 분리할 수 있었다. 2% CTAB와 2% PVP가 첨가된 buffer를 이용했을 때, 졸가시나무(Q. phillyraeoides)의 gDNA의 순도는 1.85±0.01(A260/280)였다. 18개 의 RAPD primer를 사용하여 PCR을 수행하였을 때, 가시나무에서는 15개 primer에 의해 53개의 다형질 DNA가 발견되었다. 종가시나무에서는 11개의 primer에 의해 40개의 다형질 DNA가 나타났다. 참가시나무의 경우 16개의 primer에 의해 50개의 증폭된 DNA밴드를 확인 할 수 있었다. 졸가시나무에서 14의 primer가 증폭반응을 일으켰고, 53개의 다형질 DNA가 나타났다. 이 결과들은 가시나무류의 유전분석에 이용할 수 있다.

Recently, in Korea various kinds of genetically modified (GM) crops have been imported and used as a raw material to manufacture foods and livestock feeds, but the different social concerns about the benefits and the potential risks of GM crops are being shown with a different reaction from the public. Thus a persistent management is required for the safe utilization of genetically modified organism (GMO). PCR analysis of transgene into crop is generally performed for the efficient post management of GMOs. The most important prerequisite for the application of nucleic acid detections is to decide the effective DNA-extraction methods. Particularly, in the case of processed feeds, the nucleic acids of which may be damaged by heating, high pressure, pH treatments, fermentation, etc. in processing, DNA must be extracted with high sensitivity from the samples to perform the PCR successfully. In this study, seven of DNA-extraction methods used commercially and non-commercially were compared with respect to the yields and quality of DNA extracted from livestock feeds and those crop materials. Amounts of genomic DNA obtained from the extraction methods varies according to feed configurations and crop materials. The DNA yield and uniformity of samples extracted with PG, CTAB, and QF method is greater than that obtained from other extraction methods. In the DNA integrity of the selected extraction methods, PCR analysis showed distinct amplifications and similar patterns in detecting crop endogenous genes and GMO genes. These results would be applicable for the selection of an adequate DNA-extraction method in extracting processed feeds and/or crop materials.

Recently, researches of molecular biology for the identification of root-knot nematode (RKN) species have been reported in plant quarantine. In this study, applicable and reproducible method to extract high quality genomic DNA from single nematode (Meloidogyne spp.) was developed. Also, the modified method was verified by DNA manipulation techniques such as PCR amplification and cloning. Single juvenile was floated in a drop of water and digested with proteinase K for 24 h. After that, DNA was extracted by using distilled water as extraction buffer. PCR amplification was carried out with universal primers spanning the internal transcribed spacer (ITS) region to distinguish species. When using the existing DNA detection method, quantification results showed that 42.86% of the deposited DNA was extracted. Whereas the modified DNA extraction method was increased to 100%. When PCR products test the direct sequencing using the ITS rDNA primers, it was also identified as M. javanica, M. incognita, and M. hispanica. Based on the studies conducted, the application of this modified method would be useful and efficient on plant parasitic nematode molecular assay.

전분의 사용원료를 확인하는 방법은 전분입자의 크기 또는 형태 등으로 분류하는 이화학적인 방법이 연구되었으나 원료별 또는 동일한 원료라도 품종에 따른 차이점으로 인하여 명확하게 확인하기 어려운 단점이 있어 유전자분석법을 시도하였다. 시료는 고구마 전분, 감자 전분, 옥수수 전분 및 타피오카 전분 등 총 11종을 사용하였으며, 유전자추출은 DNeasy plant mini 키트, magnetic DNA purification system 및 CTAB 방법으로 하였으며 추출유전자의 증폭을 위하여 WGA 키트로 처리하였다. 그리고 고구마, 감자, 옥수수 및 타피오카 검출을 위한 유전자 부위는 SSR (simple sequence repeat, ib-286-F/ib-286-R), 자당합성효소 (potato sucrose synthase, Pss 01n-5'/Pss 01n-3'), 전분합성효소(starch synthase, SSllb 3-5'/SSllb 3-3') 및 SSR (SSRY26- F/SSRY26-R)를 각각 사용하였다. 그 결과 대부분의 경우 WGA를 처리한 경우에는 사용원료의 확인이 가능하였다.

이번 연구에서는 중형저서동물의 생태학적 연구에 사용하는 Ludox와 Rose Bengal을 처리하였을 때, 고정액의 종류에 따른 DNA (mtCOI)의 추출 효율을 비교하고자 하였다. 실험을 위해 저서성 요각류 Tigriopus japonicus s.l.를 실험동물로 사용하였으며, 99% 에탄올과 4%포르말린의 두 종류의 고정액을 사용한 뒤 이들을 각각 대조구로 삼았다. 그리고 (1) Ludox HS40, (2) Rose Bengal, (3) Ludox

Due to the very small body size of spider mite, it is difficult to prepare DNA extraction simultaneously with slide samples from a single individual. Here we developed non-mashed DNA extraction method from a single spider mite to apply for molecular as well as morphological identification. Total genomic DNA was isolated from a single female adult using Genomic DNA extraction kit without the sample homogenization. DNA content of a single spider mite was 60-90 ng, which is sufficient for the PCR analysis. However, the quantity of extracted DNA and quality of the cuticle sample were dependent on the incubation time into the lysis buffer. Our results suggest that non-mashed DNA extraction method would be useful for the identification of very small mites as well as insects at the levels of DNA and morphology.

Background : A soil-borne pathogenic fungus, Ilyonectria radicicola (Cylindrocarpon destructans) species complex causing ginseng root rot is the major pathogen on ginseng. DNA extraction from soil is necessary to confirm the presence of ginseng root rot pathogen, I. radicicola. Methods and Results : In order to the increase the detection sensitivity of pathogens present in the soil, the existing soil DNA extraction method was modified to inctease the efficiency of the PCR reaction and to increase the amount of soil samples that can be analyed once by 500 times. For increase the DNA concentration, phenol : chloroform : isoamylalcohol (25 : 24 : 1) were used instead of chloroform : isoamylalcohol (24 : 1), and the sensitivity of PCR was increased by using purification kit. Conclusion : The modified DNA extraction method can detect ginseng root rot pathogen (I. radicicola) with DNA extraction and purification higher than the conventional method.

Polymerase chain reaction (PCR) is highly utilized for QTL analysis, positional cloning of valuable genes, and molecular breeding in crop science. Usually those experiments handle DNA samples of many genotypes (up to several thousands). However, many DNA extraction protocols require longer time using harmful chemicals such as chloroform, phenol, and liquid nitrogen. Here, we introduce a new DNA extraction method for PCR with agarose/PAGE analysis from a diversity panel of rice genotypes identified with yield enhancing traits. This protocol consists of four steps including injection of extraction buffer (20 mM Tris-HCl pH9.5, 200 mM KCl, 2 mM EDTA) into the tubes containing leaf tissues and steel balls, and crushing tissues using Geno-Grinder without liquid nitrogen, sample incubation at 65°C, and then centrifugation for removing cell debris. After centrifugation the crude extracts directly used as template DNA for PCR. Through this protocol we could complete F1 hybridity test from approximately 2,100 plants that come from 96 cross combinations with 13 SSR markers. In addition, we tested the DNA quality by PCR amplification of high GC-rich region and large target size (-2kb). From these results our DNA extraction method produces enough DNA quality for PCR and is suitable for large scale molecular analysis from rice plants.

Many important traits have been tagged allowing plant breeders to apply marker assisted selection (MAS) in rice. PCR itself is simple to set up, and requires little hands-on time. However, a crucial limiting step of MAS programs is the reliable and efficient extraction of DNA which can be performed on thousands of individuals. In this study, We describe a modification of the DNA extraction method, in which cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) is used to extract DNA from leaf tissues for suitable MAS in rice. We followed the standard 2% CTAB extraction method in all the procedure. In addition we used the 1.2 ml 8-strip tube instead of 1.5 ml E-tubes to fit the 8-multichannel pipette and employ the 96 well plate to use the swing bucket centrifuge. Our modified CTAB DNA extraction method offers several advantages with respect to traditional and simple methods. 1) adult leaf samples collected in paddy field are applicable. 2) 96 leaf samples can be homogenized only one-time by using tungsten carbonate bead and 96well block. 3) semiautomatic loading method using 8-multichannel pipette from DNA extraction to electrophoresis of PCR products. 4) our system can extract about 400 leaf samples per day by only one technicion. Therefore, this method could be useful for marker assisted breeding in rice.

The study of molecular markers to improve crops largely depends on the availability of rapid and of efficient DNA extraction methods. Here we developed a cheap and convenient method to isolate genomic DNA from rice grains suitable for large-scale microsatellite analysis. We confirmed that the isolated rice DNA is suitable for PCR analysis with STS marker and SNP marker, as well as microsatellite marker. Further, we established high-throughput DNA extraction system in a 96-well plate format which make it possible high-throughput analysis of microsatellite markers with rice grains. This implies that the new method could be a useful tool for other types of marker analysis in large scale.