R. pedestris의 중장인 M4에 Burkholderia 균이 공생하고 있으며, 이 공생균은 숙주의 면역에 이로운 영향을 준다. 본 연구실에서 외부 병원체의 침입에 따른 면역 반응으로 항균활성을 가지는 3 종류의 항균 펩타이드를 정제하였다. 그 중에서 Rip-thanatin은 18개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 2개의 시스테인에 이황화 결합이 있는 펩타이드로, R. pedestris에 많은 수의 유도체가 존재하고 있다. 이 Rip-thanatin은 병원체를 숙주에 주사하였을 때 공생균을 가지는 곤충의 M4 중장에서 공생균을 가지지 않는 곤충보다 유전자 발현양이 유의적으로 높아지는 사실을 관찰하였다. 따라서, Rip-thanatin이 중장의 면역반응에서 중요한 역할을 하며, 이는 공생균의 유무에 의해 영향을 받는 것으로 규명되었다. 본 연구진은, 숙주의 면역반응에 있어서 Rip-thanatin의 중요성을 규명하기 위해, 다양한 병원체에 대한 Rip-thanatin의 유전자 발현 정도를 관찰하고, 여러 가지 Rip-thanatin의 유도체를 합성하여 항균 활성과 Rip-thanatin의 구조적 상관관계를 규명하고자 한다.

곤충병원균인 Pseudomonas entomophila를 Riptortus pedestris의 체내에 주사하였을 때, 곤충을 사멸시키는 효과를 나타내는 물질을 찾기 위하여, P. entomophila를 배양한 배양액을 이온교환 크로마토그래피 및 크기배제 크로마토그래 피를 통해 살충 효과를 나타내는 물질을 정제 하였다. 그 결과 R. pedestris에 대해 살충효과를 보이는 독성 물질은 metalloproteinase의 일종인 AprA 단백질인 것으로 나타났다. 정제 된 AprA를 R. pedestris에 주사하였을 때, 곤충이 매우 빠른 속도로 사멸하는 양상을 보였다. AprA 단백질이 어떠한 작용 기전으로 R. pedestris에 독성 효과를 보이는지 알기 위하여, 정제 된 AprA를 R. pedestris의 체내로 주사한 후 hemocyte (혈구)의 숫자를 조사한 결과, AprA를 주사 한 직후에는 혈구의 숫자가 증가하였으나, 1시간 이후부터는 혈구의 수가 급격히 감소하기 시작하였고, 결국은 모든 곤충이 사멸하였다. 본 연구진은 AprA가 R. pedestris의 면역반응을 어떻게 억제하는지 알기 위해, AprA가 R. pedestris의 혈구를 제거하는 기작을 보고하고자 한다.

숙주와 장내 공생균 간의 상호작용을 연구하기 위한 다양한 모델 중 우리는 중장 의 특이적인 구간인 M4 내에 오직 한 종류의 공생균(Burkholderia)를 가지는 톱다 리개미허리노린재(Riptortus pedestris)를 연구 모델로써 사용하였다. 본 모델은 노 린재의 공생균을 대량으로 쉽게 분리할 수 있다는 큰 장점을 가지고 있다. 우리는 배양한 Burkholderia가 숙주안에 공생균으로 적응하면서 많은 변화가 일어날 것이 라 예상하고, 먼저 세포벽의 형태학적 차이를 전자현미경을 통해 알아보았다. 그 결과 장내 공생균의 세포벽이 시험관 내에서 배양한 균보다 안정성이 떨어져 보이 는 현상을 볼 수 있었다. 이러한 차이는 계면활성제인 SDS에 대한 감수성이 공생균 이 배양균보다 높은 것으로도 확인할 수 있었다. 우리는 M4 구간에 공생균의 세포 벽을 변화시키는 물질이 있다고 가정하고, M4구간의 추출물이 배양한 Burkholderia의 SDS에 대한 감수성을 높이는지 알아보았다. 그 결과 M4구간 추출 물을 처리한 배양균이 M4 추출물 양에 비례하여 SDS에 대한 감수성이 증가되는 것을 관찰하였다. 다음으로, 곤충 장에서 공생균의 수를 조절하는 것으로 추정되어 지는 항균펩타이드인 riptosin에 대한 감수성도 M4 추출물에 의해 증가되는지 알 아보았다. 배양균에 M4구간 추출물을 처리하면 riptocin에 더 민감하게 반응하는 것을 관찰하였다. 이러한 결과로 M4구간에 공생균의 세포벽을 변화시키는 어떤 물질을 있다는 것을 사실을 증명하였다. 더 나아가, 공생균이 M4 구간의 세포벽을 변화시키는 물질에 의해 항균펩타이드에 더 민감해져 숙주가 장내 공생균의 수를 쉽게 조절할 수 있게 된다는 것을 추정해 볼 수 있었다.

최근 톱다리개미허리노린재(Riptortus pedestris)와 Burkholderia의 공생 시스 템은 숙주와 장내 공생균 사이의 상호작용을 분자 수준에서 연구하는데 있어서 좋 은 공생 연구 모델로 인식되고 있다. R. pedestris의 중장은 총 다섯 구간으로 구성 되며 그중 M4 중장에서만 특이적으로 Burkholderia가 서식하고 있다. 선행연구를 통해 숙주의 M4는 Burkholderia가 살기에 매우 열악한 환경을 가지고 있다는 사실 을 알 수 있었다. 우리는 이러한 환경에서도 Burkholderia가 높은 서식밀도를 가지 고 있다는 점에 착안하여, 공생균의 성장에 도움을 주는 인자가 있을 것이라는 가설 을 세웠다. 숙주 장내와 비슷한 조건을 주기위해서 최소배지에 당을 제거하고 M4 추출물 만으로 공생균이 성장할 수 있는가 확인해 보니 M4 추출물의 양에 비례하 여 공생균이 잘 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 공생균 스스로가 내는 인자인지 숙주가 내는 성장인자인지 알아보기 위해 공생균을 가지고 있지 않은 aposymbiotic 곤충의 M4 추출물을 처리하여 공생균이 성장하는 것을 보았다. Symbiotic 곤충의 M4 추출물의 영향처럼 aposymbiotic곤충의 M4 추출물도 공생 균의 성장을 유도하는 것으로 성장인자가 숙주에서 나오는 것을 알 수 있었다. 숙주 가 제공하는 공생균의 성장인자의 성질을 알아보기 위해서 M4 추출물에 열처리와 proteinase K 처리 또는 phenol 분리를 통해서 단백질이나 지질이 아닌 열에 강한 물질임을 알 수 있었고, 에탄올에 침전되지 않는 것을 통해서 다당 및 핵산이 아니 라는 것을 알 수 있었다. 우리는 성장인자가 친수성의 작은 대사물일 것이라 추측하 고, 숙주의 M4 추출물에서 역상 크로마토그래피와 얇은층 크로마토그래피를 이용 하여 공생균 성장인자를 분리하였다.

톱다리개미허리노린재와 Burkholderia의 공생 시스템은 숙주와 장내 공생균의 공생관계를 연구하기 좋은 실험 모델이다. Burkholderia는 그람음성박테리아로 그것의 세포벽의 주요성분은 펩티도글리칸이다. 박테리아는 성장과 분열을 할때 에 기존에 가지고 있던 펩티도글리칸을 재활용하여 새로운 세포벽을 형성하는 것 이 일반적인 현상이다. 우리는 박테리아의 이러한 펩티도글리칸의 재활용이 Burkholderia와 노린재의 공생시스템에 어떠한 중요성을 갖는지 알아보려 하였다. 먼저 펩티도글리칸의 재활용에 관여하는 유전자들을 변이시키고, 숙주와의 공생 이 결핍된 변이 균주를 찾아보았다. 구축된 변이균주를 노린재 2령 약충에 감염시 켜 본 결과 펩티도글리칸의 분해효소 중 당과 스템펩타이드를 자르는 N-acetylmuramyl -L-alanine amidase 중 하나인 amiC가 결손된 균주는 감염을 시 키지 않는다는 사실을 관찰하였다. △amiC가 왜 감염을 시키지 않는지 밝히기 위 해 영양배지에 배양하여 관찰한 결과 세포 분리가 일어나지 못해 사슬형태를 가지 고 있음을 확인했다. 사슬형태인 변이균주의 운동성을 알아보기 위해 운동성을 조 사하여보니, 야생형 Burkholderia에 비하여 현저히 운동성이 떨어지는 결과를 보 았다. 또한, 흥미롭게도 최소배지에서 변이균주인 △amiC를 배양하면 단일세포의 형태를 가지고 있음을 확인했다. △amiC가 공생을 이루지 못하는 것이 △amiC의 사슬형태에 기인됨을 증명하기 위해, 최소배지에서 배양하여 단일세포 형태를 가 진 △amiC Burkholderia를 감염시켜 보니, 공생적 감염이 회복되는 결과를 관찰하 였다. 이러한 현상들을 통해 우리는 노린재 장내에 공생균이 감염되기 위해서는 세 포벽의 분리가 중요하다는 것을 알 수 있었다.

Serratia marcescens는 그람음성균이며 곤충병원성 박테리아다. 이 균은 인간을 포함하여 넓은 범위의 숙주에게 영향을 끼치며 특히 병원에 입원하거나 면역이 약 해진 환자에게 기회주의적 감염을 일으키는 병원균이다. 본 연구에서는 Serratia marcescens의 Db11이라는 균주를 이용하여 Riptortus pedestris 모델에서의 감염 경로에 따라 나타나는 독성의 차이에 대하여 연구하였다. Db11 균주를 Riptortus pedestris의 체액 안으로 직접 주사하여 감염시킨 경우에는 5일 안에 곤충이 죽는 결과를 보였으나, 경구를 통해 감염 시켰을 경우에는 Riptortus pedestris의 생존률 이 매우 높은 양상을 보였다. 경구를 통한 감염에서 나타나는 높은 생존률은 아마도 경구로 들어간 Db11 균주가 장내에서 없어졌을 것이라고 추측하여, 경구를 통해 감염시킨 후 장내의 CFU(colony forming unit) 를 측정해보았다. Riptortus pedestris의 장은 총 5개의 장으로 M1, M2, M3, M4B, M4로 이루어져있으며 Db11 균주는 M3에서 많이 colonization 된 것을 확인했다. 흥미롭게도 M3에서 colonization된 Db11 균주는 예상과는 다르게 계속하여 그 수가 증가하는 것을 확 인했다. 뿐만 아니라, M3에서 증가한 Db11 균은 체액으로 빠져나온다는 사실도 알 게 되었다. 흥미로운 것은 주사감염과 경구감염을 통해 다른 경로로 감염이 되더라 도 Db11 균주는 체액 안으로 들어가지만, 체액 안의 Db11 균주가 나타내는 독성은 감염 경로에 따라 커다란 차이가 있다는 것이다. 본 연구진은 감염경로에 따라 독성 의 차이가 나타나는 원인이 무엇인지에 대한 연구를 수행 중에 있다.

Burkholderia는 Riptortus pedestris의 특이적 중장기관인 M4의 crypt에서 공생 하고 있으며 숙주의 성장과 건강에 긴밀하게 영향을 미친다. 그람음성균인 Burkholderia는 가장 바깥에 lipid A-core oligosaccharide-o-antigen로 이루어진 lipopolysaccharide를 가지고 있으며, 본연구진의 선행연구에서 공생 Burkholderia 가 숙주와 공생관계를 형성 할 때 o-antigen이 소실되는 것을 알아내었다. o-antigen 이 소실된 공생균은 core oligosaccharide (core) 부분이 가장 밖에 노출됨으로, core 는 숙주와의 공생에 중요한 영향을 끼칠 것이라 가정했다. 그래서 우리는 core의 공 생에서의 역할이 무엇인지 규명하기 위해 Burkholderia의 core의 생합성 하는 유전 자가 결손된 △glycosyltransferase 1 (GT1), △glycosyltransferase 2 (GT2), △ waaF, △waaC 변이 균주를 구축하였다. 전기영동 분석에서 구축한 변이 균주의 core는 야생형 Burkholderia와 다르다는 사실을 확인하였고, 야생형 및 변이균주 를 R. pedestris에 감염시킨 후 공생균과 R. pedestris에 미치는 영향을 보았을 때 5 령 약충에서 core가 많이 손실된 △waaF, △waaC 변이 균주의 감염 밀도는 야행성 균주보다 더 낮게 나타났으며. 이 변이 균주를 공생균으로 가진 곤충은 발달이 느리 고 체중이 감소하였다. 특히 core가 가장 많이 손실된 △waaC를 공생균으로 가진 곤 충은 가장 짧은 신장과 가장 낮은 생존율을 보였다. 이 사실로 core는 Burkholderia 와 R. pedestris가 서로에게 미치는 해로운 영향을 보호함으로써 Burkholderia와 R. pedestris의 공생관계를 원활하게 한다는 새로운 사실을 발견하였다. P071

본 연구진은 최근 장내 공생균과 숙주와의 상호 작용을 이해하기 위하여 장내 공생균으로 Burkholderia 균주만을 가지는 톱다리 개미허리 노린재 (Riptortus pedestris)를 실험동물 model system으로 사용하여 흙속에 서식하던 Burkholderia 균주가 노린재에 들어가 숙주의 중장에서 공생균으로서 서식하는데 유전자를 탐색하기 위하여, 여러 종류의 변이 균주를 제작하여 어떤 유전자가 결손되면 공생균으로 정착하지 못하는가를 규명하는 연구와 숙주곤충이 가진 선천성 면역 반응을 장내 공생균은 어떻게 회피하여 가는지를 분자 수준에 이해하기 위한 기초 연구에 착수하였다. 그 결과 본 연구진은 공생균의 세포벽 성분중의 일부 유전자가 공생균이 장내 서식에 필요한 initiation, persistence, accommodation 단계에 필수적으로 작용하는 유전자임을 증명하는데 성공하였다 [PNAS (2013), AEM (2013), JB(2013), DCI (2014), ISME (2014)]. 나아가 최근에는 장내 서식하는 Burkholderia 공생균과 in vitro 배양 Burkholderia 균 사이에는 어떤 차이점이 존재하는 가를 규명하여 어떻게 장내 공생균이 숙주의 체액이나 다른 기관으로 escape 하지 못하도록 조절하는지를 규명하는데 성공하였다.