본 연구는 보다 안정된 돼지 체외수정란 생산시스템 확립을 목적으로 체외성숙배양액 mNCSU-37, mNCSU-23 및 TCM-199 가 각각 미성숙 난포란의 체외성숙, 체외수정, 체외발달에 미치는 영향을 구명하기 위하여 수행하였다. 도축돼지의 난소에서 채취한 COCs를 10% pFF가 포함된 각각의 성숙배양액에서 최종동도가 의 농도로 체외수정 시킨 다음, NCSU-23 에서 체외발달을 유도한 결과는 다음과 같다. 1. TCM-199에서 성숙시킨 난자가

본 연구는 돼지 체외수정란의 생산에 있어서 체외배양체계를 확립하기 위해 정액의 차이와 보관시간에 따른 체외성숙난자의 체외수정 및 체외발달율을 조사하였고, NCSU23와 G1.3/G2.3 배양액으로 체외배양 시 분할율과 체외발달율을 조사하였고, 체외배양액에 GSH를 첨가 시 배발달율을 조사하였다. 본 연구에서 얻은 결과는 다음과 같다. 1. 액상정액과 동결정액을 사용하여 정액에 따른 체외수정율은 각각 46.2 및 39.7%로써 액상정액을 이용한 것이 수정

The study was carried out to investigate the effects of morphology, reproductive cycle, incubation time and activation of oocytes on in vitro maturation of cat oocytes and development of IVM/IVF embryos. The results were summarized as follows: 1. When recovered from ovaries collected at different stages of the reproductive cycle (inactive, follicular and luteal stage), the developmental rates of oocytes to GV and MI stage were 72.5% and 27.5%, 57.5% and 7.5%, 62.5% and 17.5%, respectively. 2. The developmental rates of oocytes with cumulus cells to GV and MI stage in different conditions of incubation (5% CO₂, 95% O₂ and 10% CO₂, 90% O₂) were 70.0% and 27.5%, 52.5% and 20.0%, 55.0% and 12.5%, respectively. 3. The developmental rates to GV and MI oocytes when cultured at different time of incubation (17∼20, 21∼24, 25∼28 and 29∼32 h) were 67.5% and 20.0%, 67.5% and 30.0%, 62.5% and 22.5%, 65.0% and 15.0%, respectively. 4. The fertilization and cleavage rates of freshly collected oocytes with and without cumulus cells were 72.5% and 25.0%, 37.5% and 7.5%, respectively. The rates were greater in oocytes with cumulus cells than those without cumulus cells. 5. The fertilization and cleavage rates of oocytes recovered from ovaries collected at different stages of the reproductive cycle (inactive, follicular and luteal stage) were 75.0% and 25.0%, 40.0% and 7.5%, 50.0% and 15.0%, respectively.

본 연구는 미성숙 돼지난자가 체외성숙배양액인 TCM-199과 NCSU-23배지에서의 배양상태를 비교하였고, 체외성숙용 TCM-199배지에 Earle'ssalt와 Hank's salt의 첨가에 의한 세포분화와 배발달 상태를 각각 조사하였다. 1. TCM-199와 NCSU-23 배양액에 각각의 supplement를 첨가하여 5% 조건하에서 체외성숙을 유기한 결과, TCM-199 배양액에서 유의성(p<0.05)이 검증되었다. 2. 체외성숙용 TCM-199배지

This study was carried out to investigate the effect of cysteamine addition during in vitro maturation, fertilization and culture of porcine oocytes. Oocytes were matured for the first 22 h in mTCM -199 media supplemented with or without 150 μM cysteamine. They then were matured for an additional 22 h in mTCM-199 media without hormones supplemented with or without 150 μM cysteamine. When cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured in the mTCM-199 media supplemented with cysteamine, the rates of GVBD and maturation (metaphase Ⅱ) were enhanced as compared to the media without the addition of cysteamine. Also, when COCs were matured in the mTCM-199 media supplemented with cysteamine, the rates of sperm penetration, male pronucleus formation, cleavage and blastocyst formation after in vitro fertilization were enhanced as compared to the media without the addition of cysteamine. In conclusion, it was suggested that oocytes matured for the first 22 h in mTCM-199 media supplemented with 150 μM cysteamine increased the rates of metaphase Ⅱ, sperm penetration, male pronucleus and blastocyst formation were higher as compared to the media without addition of cysteamine.

본 연구는 체외성숙된 돼지난포란을 액상정액으로 수정시 수정시간과 배양배지가 난포란의 발달에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 정자농후정액 (30∼60 ml)을 채취하여 실온에서 2시간 정도 서서히 냉각시킨 후, 정액을 15 ml 튜브에 담아 800×g로 10분간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 하부의 정자는 5 ml LEN 희석액으로 1×10/sup 9/ 전자/ml가 되도록 재희석하였다. 희석된 정액은 4℃ 냉장고에 보존하였다. 미성숙 난모세포의 성숙에 사용된 배지는 26.19 mM sodium bicarbonate, 0.9 mM sodium pyruvate, 10 ㎍/ml insulin, 2 ㎍/ml vitamin B/sub 12/, 25 mM HEPES, 10 ㎍/ml bovine apotransferrin, 150 μM cysteamine, 10 IU/ml PMSG, 10 IU/ml PMSG, 10 IU/ml EGF, 0.4% BSA, 75 ㎍/ml sodium penicillin G, 50 ㎍/ml streptomycin sulfate그리고 10% pFF를 첨가한 TCM-199 배지였다. 22시간 성숙 배양한 후 난모세포는 cysteamine과 hormone들을 배제한 후 38.5℃, 5% CO₂ incubator에서 22시간 더 성숙시켰다. 성숙된 난모세포는 채취 후 2일간 4℃에 보존된 액상정액으로 수정되었다. 난모세포는 500 μl mTBM 수정 배지에서 1×10/sup 6/ 정자/ml의 농도로 1, 3, 6 그리고 9시간 동안 수정시켰다. 그 후 난모세포는 500 μl NCSU-23, Hopes buffered NCSU-23, PZM-3 그리고 PZM-4 배양배지에 옮겨서 6, 48 그리고 144시간을 더 배양하였다. 정자침투율, 웅성전핵형성율 그리고 난모세포의 난할율은 6 및 9시간 수정시간에서 1 및 3시간 수정시간 보다 높았다. 6시간 수정시 배반포형성율 (33.6%)은 1, 3 그리고 9시간 수정시 배반포형성율 (11.4, 23.0 그리고 29.6%) 보다 높았다. 배반포의 평균세포수는 6, 9, 3 그리고 1시간 수정시 각각 32.9, 27.6, 26.3 그리고 24.4개 였다. 분할된 난모세포의 배반포형성율 그리고 배반포의 평균세포수는 NCSU-23, PZM-3 그리고 PZM-4 배양배지보다 HEPES buffered NCSU-23 배양배지가 우수하였다. 결론적으로 4℃ 보존 돼지액상정액은 체외성숙된 돼지 난모세포의 체외수정에 사용될 수 있음이 입증되었다. 또한 체외성숙된 돼지 난모세포는 500 μl mTBM 수정배지에서 1×10/sup 6/ 정자/ml로 6시간 공배양시키는 것이 바람직하며, HEPES buffered NCSU-23 배양배지에서 배양하는 것이 좋다는 결과를 얻었다.

체외수정된 한우 수정란을 PCR 기법에 의한 성감별을 위해 생검하여 회복시까지 1∼2시간 동안 배양하였다. 이 성감별된 한우 수정란을 2000년 2월부터 2001년 2월까지 한우 49두와 젖소 16두에 이식하였다. 수정란이 이식된 65두의 수란우중 14두(한두 12두, 젖소 2두)가 성감별 결과와 동일한 성의 산자를 생산하였고, 전체 수태율은 21.5%를 나타내었다. 1. 총 65두의 수란우중 웅성 수정란은 35두에 자성 수정란은 30두에 이식되었고 이

본 연구는 xanthine(X)-xanthine oxidase(XO) system하에서 돼지 난자의 체외성숙과 체외수정에 대한 catalase의 영향을 검토하였다. 그 결과 돼지 난포난자가 X 또는 XO하에서 배양되었을 때, 난포난자의 성숙율은 다른 배양시간에도 불구하고 catalase 첨가 유무에 따른 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 그렇지만, X-XO-catalase system하에서 배양한 경우 유의적으로 높은 성숙율을 얻었다(P<0.05). 퇴행난자의 비율은 배양기간이 늘어남에 따라 증가되었으며, 배양 120시간에서는 catalase 첨가시보다 무첨가시에 유의적으로 높았다. 다른 한편으로, 단위발생 난자들이 배양 72시간에 높은 비율로 관찰되었지만, 다양한 배양시간에서 catalase 첨가유무에 따른 차이는 발견되지 않았다. 또 다른 실험에서, 동결-응해된 돼지 정자가 체외수정을 위해 X-XO system으로 처리되었다. 난자투명대에 대한 정자침입율은 none (P<0.05), XO, X+XO하에서 체외수정시 catalase 무첨가시보다 첨가시에 높게 나타났다. 다른 한편으로, 돼지정자가 none, X, XO, X+XO로 처리되었을 때, lipid peroxidation은 catalase 첨가시보다 무첨가시에 높은 비율로 나타났으며, 그 결과 정자침입과 lipid peroxidation에서의 변화가 상반되는 양상을 보였다. 그렇지만, 모든 조건하에서 정자의 sulfhydry (-SH) group의 함량은 catalase 첨가시에 높게 측정되었다. 난자의 투명대에 대한 정자의 접착 정도는 salt-stored 돼지 난자에 대한 정자접착을 통해서 평가되었으며, control group의 경우 X, XO, X+XO group에 비해 높은 정자접착율이 관찰되었다. 그렇지만, catalase 첨가유무에 따른 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 본 연구의 결과는 X-XO-catalase system에 대한 난포난자와 정자의 노출이 돼지에서의 체외성숙과 체외수정을 촉진시키는 것으로 생각된다.

Embryos derived from pig oocytes matured in mSOF are able to develop to blastocysts after IVF. Experiment 1 evaluated the effects of two maturation media (TCM-199 vs mSOF) on maturation rate, fertilization parameters, including penetration, polyspermy, male pronuclear formation, and the mean number of sperm penetrated per oocyte. Experiment 2 and Experiments 3 examined the effects of two maturation media on zona pellucida solubility and cortical granule distribution by transmissible electron microscopy, respectively. Experiment 4 assessed the effects of two maturation media on the in vitro embryo cleavage rate and development to blastocyst. Lastly, experiment 5 examined the cell number of blastocyst. An effect of media (P<0.05) was detected for mSOF on the mean number of sperm per oocyte. In TCM group, zona digestion time (196.515.5 vs 131.620.1 before IVF, 397.530.3s vs 185.316.4s after IVF, p<0.05) was higher in TCM-199 group. No significant effects of media was observed on cortical granule distribution between two groups by TEM. An effect (P<0.05) was observed on embryo development to blastocyst (16% vs 8%) but not on cleavage rates. No significant effects of media was observed on total cell number of blastocyst. We found that the high mean number of sperm penetrated per oocyte and the weaker zona pellucida on the basis of the digestion time was shown in pig oocytes matured in mSOF, however, porcine oocyte maturation with supplemented synthetic oviduct fluid medium (mSOF) resulted in blastocyst cell numbers comparable to those observed with Tissue Culture Medium 199.

본 연구에서는 in vitro에서 성숙된 난자의 핵성숙(Polar Body extrusion)에 소요되는 시간과 배반포 단계로의 발달능력 사이의 관계를 비교하여 조기에 발달능력을 가진 embryo를 선발할 수 있는 IVP 체계를 개발하고자 하였으며 in vitro maturation(IVM)에 따른 first polar body(PB) 형성, IVM과 IVF 시간이 oocyte의 발달에 미치는 영향과 생산된 배반포의 세포수를 평가하였다. IVM은 TCM199 배양액을 사용하였고 in vitro fertilization(IVF)은 Fer -TALP용액을 사용하였으며 in vitro culture(IVC)는 CRlaa 배양액을 사용하여 2일까지는 0.3% BSA를 3일 부터는 10%FBS와 bovine oviduct epithelial cell을 첨가하여 배양하였다. IVM 시간에 따른 PB의 출현율은 0hr(0%), 6hr(0%), 12hr(0%), 14hr(8.7%), 16hr(40.5%), 18hr(48.0%), 20hr(65%), 22(68%) 그리고 24hr(74.5%)을 보였으며 IVM 시간에 따른 cleavage 및 8cell 발달율 사이에는 유의적인 차이가 없었으나 배반포(BL) 및 8cell에서 배반포로 발달률은 18시간(BL 316, BL/8cell 82 5%)에서 가장 높게 나타났으며 24시간(BL 172, BL/8cell 608%)과 유의적인 차이를 보였다(P<0.05). IVC 7일째 배반포의 총세포수와 trophoblast(TE) 세포수는 IVM 18시간(meanS.E.; total: 131.134.0, TE: 97.629.6)에서 24시간(total: 112.217.5, TE: 80.115.6)보다 유의하게 많은 것으로 나왔으나(P<0.05) 7일째의 inner cell mass(ICM) 숫자(18hr 33.512.8 vs 24hr 32.112.0)와 8일째 ICM, TE 그리고 총 세포수에는 유의성 있는 차이가 없었다. IVM 18시간에서 PB 형성과 8cell 발달률 사이에 높은 상관성을 보였고 배반포 및 8cell에서 배반포 단계로 높은 발달률을 보였으며 생산된 배반포의 TE 숫자와 총 세포수가 유의하게 많은 것으로 나타났다. 따라서 IVM 18시간 실시하였을 경우 보다 많은 세포수를 가진 배반포 발달 가능성이 높은 embryo를 조기에 선발 가능할 것으로 사료된다.

본 연구는 소형견의 불임 해결을 위해 미숙난자를 보존 후 이용할 수 있는지의 여부를 판명하기 위하여 미성숙 난포란을 시간별로 배양한 뒤 vitrification 동결 융해후 체외수정율과 생존율을 조사하였다. 1 미숙난포란을 회수 후 1, 6, 12, 24시간 성숙 배양 후vitrification동결 융해 후 체외수정 시켰을때 수정율은 각각 31.4％. 22.5％, 11.9％ 및 5.3％로서 대조군의 수정율 60.0％에 비해 낮은 성적이었고, 회수 후 시