본 연구에서는 시가독소 생성 대장균(STEC)을 검출하 기 위해 식품공전의 polymerase chain reaction (PCR)검사 법과 loop-mediated isothermal amplification (LAMP)를 비 교하였다. PCR 및 LAMP의 검출 한계(LOD) 및 정량화 한계(LOQ), 민감도, 특이성 및 효율성을 평가하기 위해 다 양한 식품에 STEC를 접종하였다. LOD는 PCR의 경우 104 CFU/mL 이하, LAMP의 경우 103 CFU/mL 이하로 측정되 었다. LOQ 값은 PCR과 LAMP 간에 차이가 없었다. 그러 나 4가지 식품군에서 민감도는 양념육이 최대 11.1%, 간 소고기가 최소 8.1% 차이가 났다. LAMP는 네 가지 음식 유형 모두에 대해 높은 민감도와 100% 특이도를 보였다. 따라서 LAMP는 식품 유형에 따라 검출률이 비슷하고 특 이도와 민감도가 식품공전 PCR보다 우수하기 때문에 STEC 에 대한 신뢰할 수 있는 분자 검출 방법이다.

최근 한국에서 발생한 Salmonella로 인한 식중독 사고 는 2018년 9월 학교급식에서 제공된 초콜릿 무스 케이크가 원인이 되었다. 이 연구의 목적은 Salmonella Typhimurium이 인위적으로 접종된 무스케이크와 티라미수에서 3M Molecular Detection Assay 2 –Salmonella와 식품공전에 등재된 방법인 분리배지와 real-time PCR을 비교하는 것이었다. 무스케이크 2종과 티라미수 2종 25 g에 225 mL BPW를 넣고 37oC에서 24시간 동안 증균 배양하 였다. 배양 후, 3M Molecular Detection Assay 2 – Salmonella, 분리배지 그리고 real-time PCR로 분석하였다. 초콜릿 무스 케이크를 제외하고 3가지 방법은 유사한 결 과를 보였다. 초콜릿 무스 케이크에서 분리배지와 3M Molecular Detection Assay 2 –Salmonella는 모든 접종수 준에서 동일한 결과를 나타낸 반면 real-time PCR은 104 CFU/25g수준에서 1번의 양성결과를 제외하고 모두 검출 되지 않았다. 초콜릿 무스에 S. Typhimurium을 102 CFU/ 25 g 수준으로 접종하였을때, real-time PCR를 이용한 검출은 15%에서는 부분적인 음성을 나타냈고, 20-100% 함량의 초콜릿 무스에서는 모두 음성이었다. Real-time PCR 로는 chocolate이 15% 이상 함유된 식품에서의 Salmonella 균 검출이 불가능하였지만, LMAP 기반의 3M Molecular Detection Assay 2으로는 chocolate 농도에 관계없이 검출이 가능하였다.

본 연구에서는 한국 전통 식품에서 Salmonella Typhimurium 와 Listeria monocytogenes의 검출에 대하여 LAMP에 기 반한 3M Molecular Detection Assay 2 (3M MDA 2)와 식품공전에 등재된 분리배지, real-time PCR의 검출 성능을 비교하고자 하였다. 육회와 육사시미에 100–104 CFU/25 g 의 수준으로 S. Typhimurium와 L. monocytogenes을 각각 접종하였다. Citrobacter freundii와 Listeria innocua는 S. Typhimurium와 L. monocytogene의 검출에 영향을 주는 균으로 사용하였다. S. Typhimurium와 L. monocytogenes만 100–104 CFU/25 g수준으로 접종한 모든 시료에서는 분리 배지, real-time PCR과 LAMP에서 양성으로 검출되었다. C. freundii와 L. innocua를 같이 접종한 경우에서 부분적으로 양성이 나타났다. 육회와 육사시미에 대하여 real-time PCR 보다 3M MDA 2가 더 검출효율이 높음을 알 수 있었다. 분리배지가 가장 검출효율이 높았지만 3M MDA 2와 큰 차 이가 없었다. 배지를 사용하는 방법은 최소 일주일의 시간이 소요되고 PCR의 경우 inhibitor의 영향을 많이 받아 정확한 검출이 어려운 점이 있다. 그러나 LAMP에 기반한 3M MDA 2는 enrichment 후 다음 날 간단한 protocol을 통해 25분 이내로 샘플의 양성 반응을 확인할 수 있어 식중독균에 대해 신속하고 정확한 검출이 가능한 것으로 판단되었다.

식품에 존재하는 병원균을 신속검출하기 위한 방법으로 LAMP와 real-time PCR 방법을 비교 평가 하였다. S. Typhimurium, L. monocytogenes, C. sakazakii의 3종에 대해 식품공전에서 권고하는 식품 종류를 선별하여 민감도를 분석하였다. S. Typhimurium에서는 11종의 식품(햄, 닭가슴살, 계란, 돼지고기, 소고기, 오리고기, 액상음료, 샐러드, 콘프레이크, 초콜릿, 사료)중 4종(햄, 돼지고기, 시리얼, 사료)에서 LAMP보다 real-time PCR에서 검출 민감도가 10 배 이상 더 높았고, 6종(닭가슴살, 계란, 소고기, 오리고기, 음료, 샐러드)에서는 real-time PCR과 비슷한 수준을 그리고 초콜릿에서는 real-time PCR로는 검출되지 않았으며 LAMP로만 검출되는 결과가 나타났다. L. monocytogenes 와 C. sakazakii에서는 9종 모두에서 LAMP보다 real-time PCR에서 검출 민감도가 더 높았다. 또한 L. monocytogenes 에서 LAMP의 검출 민감도가 S. Typhimurium과 C. sakazakii 보다 10배 이상 낮았다. 3M MDS의 검출한계 향상을 위해 변형된 3M MDS의 민감도는 기존대비 10배 이상 증가되었다. 따라서 식품에 존재하는 병원균의 검출 을 위해 식품의 구성성분에 따라 LAMP와 real-time PCR 를 적절히 선택하는 것이 바람직할 것으로 생각되었다. 한편, 농축 방법을 이용해 LAMP방법의 민감도를 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

고리매개등온증폭법(LAMP)으로 흰등멸구를 특이적으로 구별해낼 수 있는 프라이머 세트(WBPH-65)가 핵내 ITS2영역의 전체염기서 열(KC417469.1)을 바탕으로 설계 제작되었다. WBPH-65는 총 6개의 프라이머, F3 (18 bp), B3 (18 bp), FIP (43 bp), BIP (40 bp), LF (21 bp), LB (25 bp)로 구성되는데, 전체 합한 길이가 165 bp이다. WBPH-65를 흰등멸구, 벼멸구 및 애멸구의 게놈 DNA와 65℃에서 60분간 고리 매개등온증폭 반응시켰을 때, 흰등멸구 시료에서만 증폭 산물들이 관찰되었다. 65℃에서 WBPH-65와 흰등멸구 게놈 DNA의 양과 반응시간을 달리하여 형광반응을 관찰하였을 때 40분 반응에서는 10과 100 ng DNA에서, 60분 반응에서는 0.01, 0.1, 1, 10, 100 ng DNA에서 발광여부 가 명확히 구별되었다. 그러나 20분과 30분 반응에서는 준비된 모든 DNA 양에서 발광여부 구별이 어려웠다. 한편, WBPH-65에서 LF와 BF 프라이머를 뺀 경우 60분 반응에서는 벼멸구, 애멸구 뿐만 아니라 흰등멸구의 게놈 DNA에서도 발광되지 않았다. 본 연구 결과로부터 WBPH-65가 60분 이내 반응에서 흰등멸구를 특이적으로 구별하기 위해서는 6개의 프라이머가 모두 필요하며 최소한 벼멸구와 애멸구를 구별 해낼 수 있음을 확인하였다.

Korean horn beetles, Allomyrina dichotoma (Linnaeus, 1771) reared in many local farms are suffering from a fatal viral disease as reported in 2015, and recent sequencing analysis revealed that the virus is very closely related to Oryctes rhinoceros nudivirus. In a nationwide investigation, it was concluded that the virus can transmit vertically from an infected adult to the offspring by indirect manner, and 70 to 77% of young larvae dead in early stage were diagnosed as this virus positive. Here, we report for the establishment of on-site diagnosis method for the viral disease using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay. A. dichotoma larvae were assayed for the OrNV infectivity with LAMP primers targeting OrNV_gp102 gene. To evaluate the LAMP specificity, two bacterial pathogens, Bacillus thuringiensis and Serratia marcescens, causing disease in A. dichotoma were tested along with OrNV. Only from the OrNV-infected larvae the reaction resulted positive. Also, to avoid DNA extraction process, the LAMP assay used diluted hemolymph directly and 50-fold dilution was set for diagnosis standardization and convenient on-site application for infected larvae from local farms. The LAMP diagnosis is fast and convenient for nontechnical user in the field and expected to stop this foreign virus spread all over the country.

멸구과(Delphacidae) 8종의 internal transcribed spacer 2 (ITS2) DNA 염기서열로 종간 차이 추정값을 비교하고 분자계통수를 추론하였다. ITS2 DNA 염기서열 길이는 종(species)마다 550 bp (흰등멸구)에서 699 bp (겨풀멸구)까지 차이를 보였다. 같은 Nilaparvata 속의 겨풀멸구와 벼멸구붙이 사이 의 염기서열 차이 추정값(d ± S.E.)은 0.001 ± 0.001로 가장 낮았으며, 사슴멸구와 일본멸구 사이는 0.579 ± 0.021로 가장 높았다. 벼멸구와 다른 멸구류들 과의 종간 염기서열 차이 추정값은 0.056 ± 0.008 (겨풀멸구)에서부터 0.548 ± 0.021 (일본멸구)로 구분되었다. 반면, Neighbor-joining 방법으로 추론된 분자계통수에서는 겨풀멸구와 벼멸구붙이를 제외하고 나머지 멸구류들은 독립된 다른 그룹으로 분지되었다. 벼멸구의 ITS2 염기서열을 참고하여 벼멸구 특이 고리매개등온증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 프라이머 4 세트(BPH-38, BPH-38-1, BPH-207 및 BPH-92)를 제작하였다. 이들 각각을 벼멸구, 흰등멸구 및 애멸구의 게놈 DNA와 65°C에서 60분간 반응시켰을 때, 벼멸구 시료에서만 증폭 산물들이 관찰되었다. BPH-92 LAMP 프라이머 세트로 65°C에서 벼멸구 DNA의 양(0.1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng)과 반응시간(20분, 30분, 40분, 60분)을 달리하여 형광반응을 관찰하였을 때, 20분과 30분 반응에서는 100 ng 까지에서도 발광여부 구별이 어려웠다. 그러나 40분 반응에서는 10 ng 이상에서, 60분 반응에서는 0.1 ng 이상에서 발광여 부가 명확히 구별되었다.

In 2015, we reported a viral disease extremely fatal to Allomyrina dichotoma larvae spread in the majority of the larva-rearing farms in Korea. Currently, the virus-infected larva is diagnosed by PCR-based amplification but this requires laboratory equipment and agarose gel electrophoresis. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), a highly sensitive DNA amplification method, uses DNA polymerase isolated from Bacillus stearothemophilus and a set of six primers. It has great potential for field use because DNA is amplified under single temperature and the overall reaction completes in 30 min without laboratory equipments. Here, we report the development of on-site diagnosis method for Korean horn beetle larva infected by Allomyrina dichotoma Nudivirus.

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a rapid, specific, cost-effective detection method by amplifying nucleic acid under isothermal conditions. In this study, we used LAMP for detection of Hamiltonella defensa that lives as a facultive endosymbiont of whitefly ‘Bemisia tabaci’. We designed the Hamiltonella-specific primers by targeting 16S ribosomal RNA gene and validated the specificity of one primer set. To find the optimum temperature for our primer set, the LAMP reaction was held at the temperature, 60℃, 62℃ and 65℃. As a result, 62℃ was the optimum reation temperature for LAMP reaction. Specificity of primer set was tested by the reaction to both Trialeurodes vaporariorum and B. tabaci. After the whole procedure, the amplicons by LAMP were visualized by adding SYBR Green to the reaction tube.

We developed a simple molecular detection tool that rapidly and accurately identifies Spotted wing Drosophila (SWD) without sophisticated instruments or expertise. We first identified a gene that is present in the SWD genome but not in that of any other insect species. Then, we developed the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay, which was designed based on genomic DNA of SWD specific gene. This LAMP assay detected only genomic DNA from SWD—not from Drosophila melanogaster. In addition, this assay could detect genomic DNA in SWD geographical strains collected from 8 different locations in Asia, Europe, Hawaii, and the USA. Our LAMP assay could be a useful detection tool for identifying SWD rapidly in the field. This work was carried out with the support of the Cooperative Research Program for Agriculture Science & Technology Development (Project No: PJ0116302016).

There are many other detection methods for Bursaphelenchus xylophilus. However, Baermann funnel method, PCR-based methods, which are laborious and time consuming processes that are unsuitable to rapid diagnose the Pine Wilt Disease (PWD) on the field. For these reasons, the aim of our experiment is not only to apply field diagnostic for pine wood nematode (PWN) but also to reduce total time for detection PWN in the pine trees by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) with phosphate (Pi)-induced coloration reaction which could be yes or no answer for detection of PWN has not required UV detector but it just could be discriminated by naked eyes within 30 min. Genomic DNA was directly extracted from pine wood chips by Wood Chips Direct Lysis procedure which can be used for LAMP only after simple dilution. Our results suggest that LAMP-Pi detection method, simple and rapid method for detection of PWN, could be applied to the field diagnostic for PWD.

성판별을 위한 biopsy 후 수정란의 발달율 및 동결-융해 후의 생존율 조사는 다음과 같다. 한우 체내 및 체외 수정란의 성판별을 위해서 영양막 세포의 일부를 채취하기 위해서 수정란을 biopsy 하였다. biopsy된 수정란의 생존율 조사의 결과는 체내 수정란이 100% 그리고 체외수정란이 90.0%의 결과를 나타내어 체내수정란이 체외수정란보다 biopsy 후의 생존율이 높게 나타났음을 알 수 있었다. 수정란의 성판별 비율은 체내수정란에서는 암컷과 수컷의 비율이 46.3%와 53.7%로 각각 나타나 수컷의 비율이 암컷보다 다소 높은 경향을 보였으며, 체외수정란에 있어서는 암컷과 수컷의 비율은 40.0%와 60.0%로 수컷의 비율이 높게 나타났으나, 유의적인 차이는 보이지 않았다. 성 판별된 수정란의 동결-융해 후 생존성은 완만동결 방법에 의한 수정란의 생존율은 체내수정란에서 58.8%, 체외수정란에서는 41.7% 그리고 초자화 동결 방법에서는 체내수정란의 생존율이 77.8%, 체외수정란은 57.1%로의 결과를 보여 체내수정란을 이용한 초자화 동결 방법에서 상대적으로 더 높은 생존율을 보였다.