미세방울 디지털 PCR(Droplet digital PCR, ddPCR) 법은 정량 PCR 법과 같이 형광물질을 사용하여 정량분석이 가능하다는 점은 유사하지만, PCR 반응액을 만든 후 이 반응액을 바로 PCR에 사용하지 않고 수 만 개의 동일한 크기의 미세방울(droplet)로 구획(partitioning)한 후에 PCR 반응을 수행하는 점이 기존의 PCR 법과 가장 큰 차이라고 볼 수 있다. 이렇게 구획된 나노리터 크기의 미세방울 중에서 형광신호가 검출되는 미세방울과 검출되지 않은 미세방울의 수를 계수하여 프아송 분포(Poisson distribution) 계산에 적용하면 표준검량선 없이 목적 유전자의 절대정량 분석이 가능하다. 곤충이 매개하는 질병 바이러스의 경우 소량의 바이러스 감염 여부를 확인하기 위해서 다수의 곤충 유전자를 확인해야 하는데, 이와 같이 미세방울 형태의 ddPCR을 이용하면 기존 Real-time PCR 법에 비해 극소량의 목적 유전자를 높은 민감도로 검출할 수 있으며, PCR 저해요소(inhibitor)에도 큰 영향을 받지 않는다는 장점이 있다. 또한 미세방울 방식의 디지털 PCR을 이용하면 다중 PCR 분석이 가능하여 1개의 시료에서 다양한 질병매개 바이러스를 검출할 수 있다.

최근 우리나라 연안에서 출현빈도가 점차 늘어나고 있는 침편모조류에 속하는 Chattonella는 대표적인 유해조류 중 하나로, 이들 종은 세포벽이 없어, 단순히 세포의 형태나 크기 등 광학현미경 관찰만으로는 정확하게 동정하는 것이 어렵다. 따라서 본 연구에서는 2017년 득량만에서 발생한 Chattonella 적조 시료를 대상으로 단일 세포를 분리하고, 이들 시료의 28s rDNA, rbcL, psaA 영역을 대상으로 single-cell PCR 기법을 이용하여 종 동정을 실시하였다. 현미경 관찰 결과 장축은 평균 74.0±10.1㎛이고 단축은 평균 33.1±3.6㎛로 일반적인 Chattonella의 형태적 특징을 보였다. 28s rDNA, rbcL, psaA 영역을 대상으로 한 염기서열 비교 결과에서는 세 영역 모두에서 하나의 종으로 명확히 구분되지는 않았다. 하지만 C. marina, C. marina var. antiqua, C. marina var. ovata 그룹과 99~100% 높은 서열 유사성을 보였다.

In recent years, interest in halal authentication from the domestic food and cosmetics field has been growing for advances into the overseas halal market. For halal authentication, the product must not contain haram ingredients derived from pig, dog, human, GMO, etc. In this study, the presence of haram ingredients in plant extracts (carrot, oyster mushroom, and pine needle) treated with papain and bromelain and cosmetics (mask pack and cream) containing these extracts were analyzed by PCR to confirm whether these cosmetics were suitable for halal authentication. Detection limits of the PCR method that specifically detected template DNA of human, pig, dog, and GMO were 1.29×103, 1.14×103, 1.24×102 and 2.02×103 copies/tube, respectively. PCR was not inhibited by the plant extracts or cosmetic ingredients. Results of PCR for the plant extracts or cosmetics containing these extracts were all negative. This PCR method could be used to rapidly identify the presence of haram ingredients in raw materials or final products during the manufacturing process of food and cosmetics.

V. vulnificus는 그람음성의 호염성균으로 감염 되었을 경우, 복통과 발열 등의 급성 위장염을 일으키며 만성질환자에게 급성 패혈증을 일으키는 매우 높은 치사율의 식중 독균이다. 식품 중에서 V. vulnificus를 분석하는 방법으로 는 TCBS agar와 같은 선택배지를 이용하는 방법과 PCR 을 이용한 방법이 있으나 온도, 염 및 pH 등과 같은 환경요인에 민감한 V. vulnificus의 특성을 고려하였을 때 정확한 균수 정량을 위한 정량분석법 확립의 필요성이 요구된 다. 본 연구에서는 배지 및 염 차이에 따른 V. vulnificus 생육 특성 차이에 대한 연구를 진행하였다. 그 결과, V. vulnificus 균수 정량분석에 APW 증균 배양을 이용한 MPNPCR 방법이 적합하였다. 본 연구에서 제시된 방법은 해수뿐만 아니라 어패류 등의 시료에서 V. vulnificus 균수 정 량분석에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Honey bee, Apis mellifera L., have been widely used as a model organism for biological science because of its highly developed sociality, specialized labor division and passive population management. In order to examine the expression patterns of genes putatively involved in social development in honey bee, quantitative real-time PCR (qRT-PCR) that has been widely used to investigate the expression level of target gene can be used in honey bee study. However, the selection and validation of optimal reference genes is a crucial step prior to running qRT-PCR. In the present study, therefore, the seasonal expression stability of five candidate reference genes in the abdomen of forager and nurse was investigated using three programs (geNorm, NormFinder and BestKeeper), and selected reference genes were validated by the normalization of expression level of vg encoding vitellogenin. Although three programs revealed slightly different gene stability values, overall the combination of two genes (rpS18 and gapdh encoding ribosomal protein S18 and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, respectively) was resulted in the most suitable use for normalization of the target gene in forager. However, a single gene, either rpL32 or rpS18 in the nurse or either rpL32, rpS18, or gapdh in the comparison between foragers and nurses, were suggested to be applied for normalization of seasonal and labor-specific gene expression by qRT-PCR.

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a good model organism in various areas of biological science. Since D. melanogaster has been thought to be adapted to the chemical stress environment caused by the overripen, decay and fermented fruits, identification of the genes involved in chemical tolerance and investigation of their expression patterns are essential for better understanding of the physiological evolution in D. melanogaster. For investigation of the gene expression level, quantitative real-time PCR (qRT-PCR) can be applied to quantify gene expression level and selection of reliable reference gene(s) for normalization is an accurate step. In the present study, therefore, we validated the expression stabilities of ten candidate reference genes using three softwares (geNorm, NormFinder and BestKeeper) in D. melanogaster exposed to different concentrations of acetic acid, ethanol and 2-phenylethanol. Although three programs resulted in slightly different gene stability ranks, but overall tbp encoding TATA box binding protein was most stable gene in acetic acid and ethanol exposed fly, while nd encoding NADH dehydrogenase was the most suitable reference gene in the case of 2-phenylethanol treatment. In the comparison of three chemical treatment condition, nd was also suggested to be most optimal reference gene. In addition, optimal number of reference gene for accurate normalization was calculated by geNorm pairwise analysis, and selection of multiple reference genes was suggested to be better for target gene normalization method than use of a single reference gene.

과일이나 농작물의 부패 및 발효 환경에서는 Methanol, Ethanol, Acetic acid을 비롯한 다양한 화학물질들이 생산된다. Drosophila melanogaster는 이러한 발효·부패 환경에 서식하면서 일정 농도 이상의 다양한 화학물질에 지속적으로 노출되어 생존하도록 적응되어온 것으로 생각된다. 다양한 화학물질이 포함한 환경에 안정적으로 서식하기 위해서는 D. melanogaster는 화학물질에 능동적으로 반응하여 해독 유전자나 대사 관련 유전자의 발현량을 변화 시킴으로써 발효·부패 환경에서 생성되는 화학물질에 대한 높은 내성을 가지고 있을 것으로 판단된다. 현재까지 유전자의 발현량 측정을 위해 real-time PCR를 이용하여 reference gene의 발현량을 기준으로 정량화하는 방법이 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 조직별, 환경별, 발달단계를 비롯한 다양한 조건에서 안정적으로 발현되는 reference 유전자 선정이 필수적으로 선행되어야 하므로 본 연구에서는 발효·부패 환경에서 생산되는 두 화학물질인 Methanol과 Ethyl Acetate에 노출된 D. melanogaster에서 안정적으로 발현되는 reference gene을 찾는 연구를 실시하였다. 본 연구에서는 다양한 농도의 Methanol과 Ethyl Acetate을 D. melanogaster에 노출시킨 후 RNA 추출과 cDNA 합성을 실시였고, 5가지 후보 reference gene (hsp22, nd, rpL18, tbp and ef-1b)의 안정적 발현 여부를 qRT-PCR을 통해 조사하였으며, 유전자 발현의 안정성을 측정하는 3가지 프로그램(geNorm, NormFinder, BestKeeper)을 이용해 비교·분석하였다. 본 학회에서는 연구의 과정과 그 결과를 발표하고자 한다.

기후온난화 현상이 지속되고 있는 제주지역에서 환경적으로 다른 지역 모기의 계절적 발생밀도를 조사하기 위해 제주시의 국제공항, 항만 구역과 축사 그리고 서귀포 도심지의 11지점을 선정하여 3월부터 11월까지 매달 2회씩 Black light trap과 BG sentinel trap을 이용하여 모기를 채집하였다. 채집된 모기는 5속 7종. 6,042마리였으며, 이 중 빨간집모기(Culex pipiens)가 4,159마리(68.8%)로 우점종이었으며 흰줄숲모기 (Aedes albopictus)는 1,348마리(24.4%)였다. Black light trap를 이용한 채집에서 중앙동주민센터는 트랩당 72.8마리를 채집하여 모기 밀도가 가장 높게 나타났으며 제주국제공항은 트랩당 1.4마리로 가장 낮게 나타났다. BG sentinel trap을 이용한 채집에서는 항만에서 트랩당 71.7마리로 가장 많았고 도심지의 걸매생태공원에서 28.3마리로 가장 낮았다. 시기별로 모기의 밀도는 5월부터 증가하기 시작하여 8월에 1,156마리 (19.1%)로 가장 높은 밀도를 나타내었다. 채집된 암컷모기를 종별, 시기별, 지점별로 나누어 pool당 50마리 이하로 설정하여 총 364 pools에서 flavivirus 존재여부를 real time RT-PCR로 검사하였으나, 검출되지 않았다.

본 연구는 국내에서 생산되거나 해외에서 수입되어 국내에서 유통되는 수산물 중에서 두족류를 문어류, 낙지류, 오징어류, 주꾸미류, 꼴뚜기류의 5개 그룹으로 구분하여 분석하였다. 두족류 5개 그룹을 판별을 하기 위해 미토콘드리아에 존재하는 유전자를 분석하였고, 그 중에서 COI (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I), 16s rRNA (16s ribosomal RNA), 12s rRNA (12s ribosomal RNA) 내에서 상당히 유사한 DNA 서열 부분과 일부 서열 변화 부분이 확인되었다. 명확하게 두족류 5개 그룹 판별을 하기 위해 COI, 16s rRNA, 12s rRNA 유전자의 일부 서열 변화 부분에서 그룹 특이적 프라이머 세트를 디자인하였다. 국내·외에서 확보한 두족류 시료(참문어, 낙지, 살오징어, 아메리카 대왕오징어, 갑오징어, 주꾸미, 모래주꾸미, 하이야주꾸미, 참꼴뚜기, 창꼴뚜기, 한치꼴뚜기)의 genomic DNA을 추출하여 각 그룹의 특이적 프라이머를 이용하여 SYBR 기반의 real-time PCR 시스템에 의해 분석되었고, threshold cycle (Ct) value와 같은 real-time PCR 결과 분석에 의해 두족류 내 그룹 판별이 가능하였다(Table 3).

고추는 한국에서 매우 중요한 양념 중 하나이다. 하지만 수입 고춧가루와 다진 양념(다대기)에 부과되는 관세율(45%/270%)의 차이로 인해, 다진 양념이 수입된 후, 건 조 및 분쇄 과정을 거쳐 고춧가루로 제작되고 있는 실정 이다. 본 연구에서는 종 특이 PCR 기술과 whole-genome amplification 방법을 접목하여 고춧가루(N=45) 및 다진 양 념(N=5) 제품의 사용원료(고추, 마늘, 양파, 파, 생강)를 분 석하였다. 모니터링 결과, 39개 고춧가루 제품은 표시사항 을 준수하였으며, 6개 고춧가루 및 5개 다진 양념 제품은 제조 기준을 충족시키지 못했다. 따라서 분석 제품의 22% 가 표시사항을 준수하지 못한 것으로 밝혀졌으며, 본 연구에 사용한 분석 방법은 고춧가루 제품에 사용된 원료 분석에 적합한 방법임을 입증하였다.

Honey bee has been widely used as a model insect for biological sciences because of its sociality and specialized labor division. For the investigation of the seasonal and labor-dependent expression patterns of genes putatively involved in its sociality, quantitative real-time PCR (qRT-PCR) can be applied to quantify gene expression level and selection of reliable reference gene(s) for normalization is an accurate step. In this study, using three softwares (geNorm, NormFinder and BestKeeper), we evaluated seasonal expression stabilities of four reference genes that have been widely used for qRT-PCR in forager and nurse heads. Among four candidates, two genes, rpS18 and gapdh, were suggested to be the optimal reference genes for qRT-PCR.

Mycoplasma (M.) felis and M. canis is related with pneumonia or conjunctivitis in domestic cats and several diseases in a variety of other animals, including lower respiratory tract disease or pleuritis. Polymerase chain reaction (PCR) assays has been reported as an easy and useful method. It could be conducted even on nasal swab samples as a non-invasive rapid testing tools for large numbers of Mycoplasma species. However, PCR assays have to conduct multiple assays because of a lot of Mycoplasma species. Therefore, it need to perform several tests and reveal time consuming procedures. In this study, we developed a sensitive and specific multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay that detects simultaneously two species like as M. felis and M. canis. The simultaneous detection of M. felis and M. canis primers were used to differentiate two mycoplasma species. The target DNA fragments were specifically amplified M. felis and M. canis PCR with 16S ribosomal DNA primers. Single and mixed Mycoplasma species DNA templates were submitted to validate the specificity of the multiplex PCR. The corresponding specific DNA products were amplified for each pathogen. The detection limit of the developed multiplex PCR is 102 pg with M. felis and M. canis DNA. Furthermore, the developed multiplex PCR detected successfully M. felis in feline nasal specimens. The multiplex PCR assay provides a novel tool for simultaneous detection and differentiation of M. felis and M. canis in cats.

Salmonella는 전세계적으로 식중독을 유발하는 주요 원 인 균으로서, 식중독을 유발하는 Salmonella를 신속하게 검출하는 방법은 식품 안전을 위한 중요한 도구이다. Realtime PCR은 식중독균을 검출하기 위한 신속검사법으로 널 리 사용되어 왔다. 최근에는 NBS LabChip real-time PCR 이라는 새로운 시스템이 칩타입으로 조작이 간편하며 초 고속의 real-time PCR 시스템이라는 보고가 있었다. 본 연 구에서는 살모넬라의 신속한 검출을 위하여 NBS LabChip real-time PCR에 기반하여 real-time PCR 반응 시간이 20 분 이내인 검출법을 확인하고자 하였다. 프라이머와 프로 브 설계를 위해 두 개의 타겟 유전자(invA, stn)가 선택되 었으며, 특이도와 민감도(검출한계)를 평가함으로 개발된 검출법을 검증하고자 하였다. 본 연구에서는 특이도 검증을 위해 Salmonella 균주 42주와 Non-Salmonella 균주 21 주를 포함하였으며, 본 방법으로 Salmonella 42주에 대해 서만 정확하게 검출이 가능하였다. 검출한계는 살모넬라 genome DNA 기준으로 101 copies/μL 였으며, 소시지에서 는 4시간 증균 이후 접종균수로서 101CFU/g 에서 102 CFU/ g까지 검출이 가능하였다. 본 연구에서 개발된 검출법은 신속한 식중독 원인조사에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

This study is for the consideration of the existence tendency of Kudoa septempunctata in olive flounder. In general, muscle has shown a strong PCR positive reaction in spores containing tissues rather than non-containing tissues. However, blood PCR results showed opposed tendency. In various organs of the tested fish containing spores in muscle tissue, heart had shown positive reaction along with muscle at PCR analysis. Muscle fiber necrosis was observed at the histological observation, and this degeneration was common in both samples. The one sample was the PCR positive muscle containing spore and the other was the PCR positive muscle non-containing spore. Both of muscle tissues indicated a positive reaction at ISH (in-situ hybridization) against K. septempunctata.