laccase 유전자를 겨울우산버섯 내에서 발현을 증가시 켜 리그닌 분해효소의 활성을 강화시키고 리그닌 분해능 이 강력한 균주를 얻고자 형질전환을 시도하였다. 겨울우 산버섯 형질전환용으로 개발한 pHYgpt 벡터에 laccase 유전자를 삽입하여 과발현용 pHYlac1 벡터를 제작하여 REMI 방법으로 형질전환을 실시하였다. 항생제가 포함된 선발배지로부터 각각 13와 28개의 균사체를 선별하였고 여기서 genomic DNA를 분리하고 벡터 primer로 PCR 수행하여 pHYgpt는 9개, pHYlac1는 23개의 형질전환체 가 확인되었다. 염료 (Poly R, RBBR)가 첨가된 고체배지 에 형질전환 균사체를 배양했을 때 pHYlac1 형질전환체 는 야생형 균주에 비해 비교적 높은 탈색능을 보였다. 액 체배지 배양에서 laccase활성을 조사하기 위해 배지의 상 등액과 o-tolidine을 반응시켜 산화에 의해 나타나는 발 색의 정도를 분광기로 측정하였다. 벡터의 형질전환체는 전체 배양기간에서 야생형 균주와 활성이 비슷하게 나왔 으며 laccase가 과발현되는 pHYlac1의 형질전환체는 전 배양기간에서 높은 활성을 보였다. 배양기간과 균주에 따 라 차이는 보였지만 20일 전후에서 야생형 균주에 비해 10배에서 50배 이상 높은 활성을 보였다. 본 연구에서 형 질전환용벡터와 형질전환법을 통해 분자생물학적 기술을 이용한 분해능이 우수한 균주를 개발할 수 있는 형질전환 시스템이 안정적적으로 확립되었으며 앞으로 형질전환 체를 이용한 리그닌 분해와 이와 유사한 구조를 갖는 환경 호르몬의 분해를 위한 기술 개발에 적용할 예정이다.

농업과학기술원에서는 농업생명공학연구원, (주)마크로 젠, 건국대학교, 한경대학교, 상지대학교, 경북대학교 연 구팀과 함께 국내토종 팽이버섯에 대하여 유전체 완전염 기서열 해독 및 버섯유전체의 기능분석을 위한 연구를 바 이오그린21사업의 유전체개발이용연구단 과제로 수행하 고 있다. 팽이버섯 형질전환 연구는 이 프로젝트의 하나로 서 유전자 기능분석 기반을 구축하기 위한 과제로 국내에 서 수집된 야생팽이균주 (KACC42777)를 대상으로 Agrobacterium을 매개로 한 형질전환을 수행하여 변이 체 pool을 작성하고자 하는 목적을 가지고 있다. 팽이버섯 의 형질전환을 위하여 hygromycin 저항성 스크린의 가능 성을 확인하기 위하여 자실체 주름조직을 이용한 Agrobacterium 형질전환 체계를 확립하였다. 형질전환 용 벡터 strain은 hygromycin 저항성과 gpd promoter를 가지고 있는 AGL1 pBGgHg을 사용하였으며 항생제 농 도 30ug/ml에서 13.3%의 효율로 형질전환체 156개를 얻었다. 형질전환체는 PCR에 의하여 확인하여 유전자삽 입이 확실한 균주는 균총의 특성을 조사하였으며, 형질전 환체 자실체특성을 확인하기 위하여 병재배를 수행하였 다. AMT 방법으로 형질전환되어 얻어진 균주는 Hygromycin resistance gene이 삽입된 위치 주변의 염 기서열을 찾기 위해서 Inverse-PCR 조건을 구명하였다. 염기서열 완전해독으로 얻어지는 정보와 이들 염기서열 정보는 유전자의 기능을 대량분석하는데 유용하게 이용 될 수 있을 것이다. 본 연구에서 얻어진 모든 형질전환체 는 이후의 연구에 사용하기 위하여 특성을 DB화 하고 장 기보존되고 있다. 이 연구과제를 통하여 팽이버섯의 대량 유전자 분리 및 기능분석 기술 확립으로 유용유전자 발굴 시스템을 구축함으로써 새로운 분자육종 소재를 발굴하 여 제공하고, 팽이버섯 형질전환기술의 확립으로 Postgenome 연구 tool로 활용할 수 있을 뿐 아니라 팽이버섯 유전체 해독정보를 기반으로 한 약리작용 및 발현·대사 관련 유전자 기능분석으로 고부가성 생물소재를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

버섯 종류에 따른 하이그로마이신 농도별 균사생장 조사 결과, 양송이·영지·상황·만가닥·맛버섯은 25 ㎍/㎖, 버들송이·잎새버섯·백계버섯은 50 ㎍/㎖, 신령버섯은 75 ㎍/㎖, 느타리버섯속은 25~75 ㎍/㎖ 농도에서 균사 생 장이 정지되었다. 버섯 종류별 자실체의 주름살에 진공처 리로 아그로박테리아를 침투하여 형질전환을 실시한 바 큰느타리, 버들송이, 신령버섯에서는 형질전환체를 얻을 수 없었다. 아그로박테리아를 이용하여 양송이 여러 품종 에 형질전환을 실시한 바 국내의 705품종은 AGL1 pBGgHg 균주에서 56%의 형질전환율을 얻을 수 있었고, 실반의 A15 품종의 형질전환율은 AGL1 pBGgHg 56%, AGL1 pGreen hph1 60%, LBA1126 pBGgHg 46% 이었 다. 양송이 A15품종의 주름살에 아그로박테리아 AGL1과 L! BA1126을 이용하여 형질전환을 할 때 AGL1이 LBA1126에 비해 형질전환율이 양호했다. 또한 아그로박 테리아를 세포내로 침투시킬 때 진공처리가 고주파에 비 해 양호하였으며, 진공처리시 형질전환율은 AGL1 pG.hph1 60%, AGL1 pBGgHg 56%로 조사되었다.

본 연구는 사람 H-transferase가 과발현하는 돼지 체세포주를 개발하는데 있다. 돼지 세포에 사람 H-transferase 유전자를 발현시키는 것은 이종간 장기 이식에 있어서 초급성 거부 반응을 방지하기 위한 한 가지 방법이다. 본 연구에서는 과발현 벡터를 구축하기 위하여 사람 H-transferase을 HepG2 세포로부터 동정하였으며, 이 유전자를 CMV promoter를 이용하여 발현할 수 있도록 포유동물 발현 벡터인 pRc/CMV 벡터에 삽입하였다. 또한, 돼지 산자의 귀 세포를 이용하여 체세포를 수립한 후 jetPEI DNA transfection reagent를 이용하여 벡터를 도입하였고, 300 μg/ml의 G418로 12일간 선별하였다. PCR을 이용하여 선별된 colony들을 분석한 결과, 벡터가 도입되었음을 확인하였고, RT-PCR을 이용하여 사람 H-transferase mRNA가 발현하는 것을 확인하였다. 본 연구에서 확립된 세포주는 사람 H-transferase가 과발현하는 형질 전환 돼지의 생산에 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

본 연구는 온시디움에 있어서 particle bombardment 및 아그로박테리움 매개 형질전환 최적 조건을 구명하 고자 실시하였다. 실험재료는 ‘Sharry Baby’의 PLBs를 사용하였으며, 유전자는 pCAMBIA3301 vector에 삽입 되어 있는 bar와 intron-gus를 사용하였다. Particle bombardment 법에 있어서는 직경이 0.6 μm인 금 입자 에 유전자를 혼합하여 9 cm의 거리에서 1,100 psi 헬륨 가스 압으로 발사하는 것이 유전자 도입에 효과적이었 다. 아그로박테리움 매개법에 있어서는 미성숙 PLBs를 O.D 0.6 정도인 균주에 접종 후 5일간 광조건 없이 공동 배양하는 것이 유전자 도입에 효과적이었다.

본 연구에서는 SV40 Tag을 마우스 albumin 유전자의 promoter/enhancer 조절 하에 발현하도록 설계된 재조합 유전자를 마우스 1세포기 수정란에 미세 주입하여 형질 전환 마우스를 제작하고 이들의 인체 간암 모델로써의 적합성을 조사하였다. 형질 전환이 확인된 총 11개체의 founder 생쥐들 중 4개체가 간암을 일으켰고, 두 개체는 신장암을, 한 개체는 피부 및 뇌에서 종양을 각각 일으켰다. 이들로부터 외래 유전자를 계대 유전하는 3가계를 얻었다(#1-2, #1-6, #1-11). 이들 가계의 자손들에서 8주령(#1-2, #1-6) 혹은 10주령(#1-11) 시부터 간암이 반복적으로 발생되었으며, #1-11 founder 개체에서 폐로 암세포가 전이된 것 외에는 다른 조직에서의 형태학적 변이가 발견되지 않았다. 간암 발생은 조직학적 변화에 따라 3단계로 나눌 수 있었다. 즉, 출생에서 3주령까지는 간세포의 과량증식을 보이나 세포핵의 이상은 관찰되지 않았으며, 4주령부터 7주령(#1-2, #1-6) 혹은 9주령(#1-11)까지는 diffuse liver cell dysplasia를 나타내지만 tumor nodule은 발견되지 않았고, 그 이후에는 liver dysplasia를 배경으로 간암이 발생하였다. 본 연구에서 작출한 간암 모델 마우스는 인체 간암과 일부 유사한 소견을 보였는 바 인체 간암 기전 연구를 위한 유용한 동물 모델로 이용할 수 있을 것으로 생각된다.