자연생태계에서 수집된 분변, 털 등 비침습적 시료는 야생 동물의 상태나 특성을 분석적으로 평가할 수 있는 좋은 재료가 된다. 특히 비침습적 시료에 대한 유전자 분석 결과는 야생동물의 유전학적, 생태학적 특성을 이해할 수 있는 생물학적 근거를 제공할 수 있다. 야생생물-특히 멸종위기야생생물 등-에 대한 분석에 있어 비침습 시료의 활용은 개체의 포획, 채혈, 조직 수집 등에 따른 생체 손상 없이 진행될 수 있는 좋은 시료가 된다. 본 연구는 우리나라에서 멸종위기 야생생물 Ⅰ급으로 지정되어 있는 산양 집단의 성별 구조분석과 생태복원을 위한 기초자료 확보를 위하여 성 판별을 위한 새로운 분석기법을 마련하고자 하였다. 산양의 분자적 성판별을 위하여 포유동물인 산양의 성염색체(X-, Y-염색 체)에서 공통적으로 암호화되어 있는 zinc finger-X, -Y(ZFX, ZFY) 유전자와 수컷에서만 출현하는 sex-related region Y (SRY) 유전자의 서열을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 위한 시발체(primer)를 고안하였다. 새롭게 제작한 시발체들과 기존 연구에서 보고된 포유동물-범용 시발체들을 사용하여 강원도 오대산 국립공원과 서울 인근에 위치한 용마산에서 수집된 산양 비침습적 시료(분변, 털)와 혈액 유래의 DNA를 대상으로 PCR 시험을 수행하였다. 기존에 보고된 범용 시발체를 이용한 시험결과에서는 대다수의 시료에서 비특이적인 PCR 증 폭산물들이 같이 출현하였고, 암-수를 판독할 수 있는 명확한 실험결과를 얻을 수 없었다. 본 연구에서 고안한 시발체를 이용하여 혈액 유래의 DNA를 대상으로 시험한 결과, SRY 시험에서 수컷에서는 단 하나의 PCR 증폭산물이 관찰되고, 암컷에서는 관찰되지 않았다. ZFX-ZFY 시험결과에서는 길이가 다른 두 개의 산물이 수컷에서 관찰되고, 암컷은 단 하나의 PCR 산물만 관찰되었다. 또한 SRY 유전자 성판별 결과와 ZFX-ZFY 성판별 결과는 정확히 일치하였다. 비침습 적 시료에 대한 성판별 시험에서 SRY 체계와 ZFX-ZFY 체계에서 시료들이 암-수로 구분되었고, 대부분의 시료에서 SRY 시험결과와 ZFX-ZFY 시험결과가 일치하였다. 분석결과 중 2 건의 시료에서 ZFX 또는 ZFY 유전자 절편이 검출되지 않는 양상을 보여, 이들 시료에 대하여 DNA 분자 barcoding에 이용되고 있는 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)의 cytochrome oxydase I (COI) 유전자 서열을 추가로 분석하였다. 해당 시료들은 서열의 일부 또는 전체적으로 DNA 서열이 이질적(heteroplasmic)인 현상을 나타내었으며, 이는 증폭된 유전자 서열이 하나의 기원에서 유래된 것이 아니라, 2 개체 이상이거나 2 종 이상에서 유래되었음을 의미한다. 결과적으로 동종 또는 다른 종에 의한 오염이 부분적으로 분자 수준에서의 성 판별 시험을 저해할 수 있음을 보여주는 결과이다. 그럼에도 불구하고, 이 연구를 통해 산양 비침습 시료에서 암-수성별에 대한 정보를 얻을 수 있었다. 본 연구에서 새롭게 고안한 ZFX-XFY, SRY 유전자에 대한 PCR 시험방법은 기존에 고안된 방식에 비해 더 좋은 효율을 나타내었으며, 오대산국립공원지역과 서울 용마산에서 수집한 산양 비침습 시료(분변, 털)에서 암-수성별에 대한 정보를 확인할 수 있었다. 본 연구에서 고안한 산양 성판별 시험방법을 현재 지역적으로 파편화된 양상을 나타내는 지역별 산양집단의 성비 분석에 적용한다면, 포획, 채혈, 조직 수집 등을 통한 산양 생체에 대한 피해 없이 비침습 시료를 이용하여 집단의 성비를 산출할 수 있는 자료를 확보 할 수 있을 것이다. 또한 집단의 성비 정보는 지역별로 산재 되어 분포하고 있는 개별적인 산양집단의 보호와 생태복원을 위한 전략마련에 필요한 가치 있는 생태정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

The purpose of this study is to produce wanted sex progeny of genetically confined White Hanwoo (albinism) with preselected sex sperm. One bull of White Hanwoo was chosen for semen donor and X sperm was sorted by MoFlo XDP cell sorter. To compare the pregnancy and birth rates, KPN straw was used as control, total number of unsorted sperm was 20×106/straw. Sexed X frozen semen with 2×106 cells or 4×106 cells per straw were in seminated twice on Hanwoo heifers. The abnormality of the sexed X semen was 24.9 ± 7.31% and distal reflex abnormality of mid piece was significantly (p<0.05) higher (11.7%) compared with that of KPN 768 (5.6%). There were no differences on the pregnancy and birth rates between 2×106 cells or 4×106 cells of X-sperm but KPN semen showed significant differences (p<0.05). The pregnancy rates of KPN 768, 2×106 cells and 4×106 cells X-sperm of White Hanwoo cattle were 85.0%, 26.3% and 50%. The birth rates were 80.0%, 15.8% and 21.4%, respectively. The female offspring rates of KPN 768, 2×106 cells and 4×106 cells X-sperm of White Hanwoo cattle were 43.8%, 100% and 100% (p<0.05). These results indicated that sex sorted White Hanwoo could be used for the production of wanted progeny with 2×106 cells/straw for AI. To increase the efficiency of calf production, the sperm number of sex sorted semen will be optimized for sex selection of White Hanwoo progeny.

The present study was conducted to compare on embryo survival rates by blastomere isolation methods, and establish the optimal PCR procedure for perform the sexing of bovine blastocysts produced by IVF. IVF embryos used in the study was used the Bisected or Sliced methods for blastomere isolation, and the survival rates of blastocyst with rapid way of sexing PCR was assessed. In the present study for survival rates in blastocyst was the total cleavage rate was 75% and a blastocyst development among cleaved embryos was 40%. Survival rate of embryos treated with intact, bisected or sliced method was 100, 63.3 or 81.3%, respectively. Therefore, survival rate of embryos treated with sliced method was higher compared to that of embryos treated with bisected method. The sexing rate of female or male was not significantly different between S4BFBR primer and BSY + BSP primer (1.75 : 1 vs. 1.43 : 1), respectively. Because of the PCR amplification using the S4BFBR primer was simpler method than multiplex PCR amplification method. Furthermore, the accuracy of sexing rate and reduction of PCR work time between 2-step and 3-step of PCR methods was 98.0% / 1.5 hr and 97.0% / 3.5 hr, respectively. Based on these results, it can be suggested that the sliced and PCR methods we developed was very effective method to reduce time consuming and procedure of PCR amplification for sexing with the increase of survival rate on the blastocyst.

성판별을 위한 biopsy 후 수정란의 발달율 및 동결-융해 후의 생존율 조사는 다음과 같다. 한우 체내 및 체외 수정란의 성판별을 위해서 영양막 세포의 일부를 채취하기 위해서 수정란을 biopsy 하였다. biopsy된 수정란의 생존율 조사의 결과는 체내 수정란이 100% 그리고 체외수정란이 90.0%의 결과를 나타내어 체내수정란이 체외수정란보다 biopsy 후의 생존율이 높게 나타났음을 알 수 있었다. 수정란의 성판별 비율은 체내수정란에서는 암컷과 수컷의 비율이 46.3%와 53.7%로 각각 나타나 수컷의 비율이 암컷보다 다소 높은 경향을 보였으며, 체외수정란에 있어서는 암컷과 수컷의 비율은 40.0%와 60.0%로 수컷의 비율이 높게 나타났으나, 유의적인 차이는 보이지 않았다. 성 판별된 수정란의 동결-융해 후 생존성은 완만동결 방법에 의한 수정란의 생존율은 체내수정란에서 58.8%, 체외수정란에서는 41.7% 그리고 초자화 동결 방법에서는 체내수정란의 생존율이 77.8%, 체외수정란은 57.1%로의 결과를 보여 체내수정란을 이용한 초자화 동결 방법에서 상대적으로 더 높은 생존율을 보였다.

혈통이 등록된 우수한 한우 공란우로부터 회수한 수정란을 간편한 방법으로 성 판별하여 우수한 암송아지를 생산하고자 실시한 결과는 다음과 같다. 회수한 수정란을 punching 또는 bisection 방법으로 biopsy하여 Loop-mediated isothermal amplification법으로 성 판별하였으며, 암컷으로 예측되는 성 판별 수정란을 6두의 수란우에 이식하여 2두가 임신되었고, 수정란 이식 후 278일과 285일에 정상적인 암컷 송아지를

The possible use of micromanipulative biopsy and PCR of the biopsied embryonic cells was tested to produce sexed bovine embryos in practical terms. By micromanipulation and PCR techniques, higher survival rate and accurate sexing of demi-embryos were btained. Bovine oocytes matured and fertilized in vitro were co-cultured with bovine oviductal epithelial cell (BOEC) monolayer in USU-6 medium supplemented with 15% FBS, and the embryos of 37% (327/885) were developed to blastocysts. Among 111 blastocysts produced by invitro, only 7 (6.3%) embryos were found unable to determine their sex, probably due to the loss of cells, since no PCR product was found from those cells. All the remaining 104 (93.7%) demi-embryos survived micromanipulation and demonstrated male-specific product or bovine-specific product alone suggesting that correct sexing of the sample. Forty-three point one percent(25/58) of manipulated and cryopreserved demi-embryos after thawing were survived. Final verification of the sexed embryos is necessary to make sure the same sex in fetus and newborn calf upon embryo transfer. The established sexing method on a large number of bovine embryos from previous and this study suggests that this a could be used practically in the field.

SUMMARY I. 서 론 II. 재료 및 방법 III. 결 과 IV. 고 찰 V. 적 요 VI. 인용문헌

우수정란의 이식전 성판별이 관한 연구를 수행하기 위하여 GTH와 PGF투여에 대한 난소반응과 회수난자의 발유단계별 동결융해후 생존성을 조사하였으며, 이식전 수정라느이 성판별을 위하여 H-Y항체 처리후 정상발육 난자의 염색체를 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 웅성 비장세포(male, spleen cells)를 면역원으로 mouse와 rat에 투여, 항혈청의 항체를 확인한 결과 mouse에서는 C57 BL계통과 rat에서는 DonRyu 계통이 항체생산