고추역병균(Phytophthora capsici)은 고추 생육 전반에 걸쳐 병을 발생시켜 농가 소득에 큰 손실을 일으키고 있다. 고추 역병균 저항성은 양적 형질 유전자좌(Quantitative Trait Loci, QTL)에 의해 조절되며 주동 유전자는 고추의 5번 염색체에 존재한다고 보고 되었지만, 후보 유전자의 선발 및 저항성 유전자 규명 연구는 아직 초기 단계이다. 특히, 고추는 형질전환이 어려운 작물로써 병원균과의 상호작용 연구를 통한 저항성 유전자 동정에 제한이 많다. 반면 고추와 같은 가지과 작물인 담배(Nicotiana benthamiana)는 병원균 상호작용 모델로 알려져 형질전환을 통해 저항성 유전자 규명에 활용된다. 본 연구에서는 고추 역병 저항성 기작 규명을 위한 기초 연구로써, 식물 저항성 유사 유전자(Resistance Gene Analog, RGA)를 선발하고, 이들 유전자들에 대한 담배 형질전환 기법 최적화 연구를 수행하였다. 고추 5번 염색체에 존재하는 고추 역병 저항성 분자표지들을 분석하여 RGA 후보 유전자인 CaNBARC105, CaNBARC112 유전자를 동정하였다. 이들 유전자들에 대해 Agrobacterium tumefaciens를 매개체로 하여 고추 RGA가 삽입된 담배 형질전환체를 개발하였다. 형질전환 여부는 유전자 특이적인 서열을 이용한 genomic PCR과 RT-PCR 검증을 통해 이들 형질전환 된 담배들의 생육 및 발달에 영향이 없다는 것을 확인하였다. 본 연구는 향후 고추 병 저항성 후보 유전자들이 삽입된 담배 형질전환체는 고추 역병 저항성 유전자 규명 및 기작 연구에 기반이 될 것이다.

The Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer is widely used to generate genetic transformation of plants and transient assay of temporal exogenous gene expression. Syringe infiltration system into tobacco (Nicotiana benthamiana) leaves is a powerful tool for transient expression of target protein to study protein localization, protein-protein binding and protein production. However, the protocol and technical information of transient gene expression, especially double strand RNA (dsRNA), in tobacco using Agrobacterium is not well known. Recently, dsRNA is crucial for insecticidal effect on destructive agronomic pest such as Corn rootworm. In this study, we investigated the factor influencing the dsRNA expression efficiency of syringe agro-infiltration in tobacco. To search the best combination for dsRNA transient expression in tobacco, applied two Agrobacterium cell lines and three plant vector systems. The efficiency of dsRNA expression has estimated by real-time PCR and digital PCR. As a result, pHellsgate12 vector constructs showed the most effective accumulation of dsRNA in the cell. These results indicated that the efficiency of dsRNA expression was depending on the kind of vector rather than Agrobacterium cells. In summary, the optimized combination of transient dsRNA expression system in tobacco might be useful to in vivo dsRNA expression for functional study and risk assessment of dsRNA.

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AtMT) has been widely used for generation of fungal transformants and recently applied to Beauveria bassiana. In this study to comprehend how the AtMT promoter influences on the expression of selection marker (hygromycin B resistance gene; hph), two different Ti-Plasmids were constructed: pCeg (gpdA promoter-based) and pCambia-egfp (CaMV 35S promoter-based). Putative transformants were subjected to the PCR, RT-PCR and qRT-PCR to inspect the T-DNA insertion rate and gene expression level. In conclusion, more than 80% of the colonies succeeded in AtMT transformation and the hph expression level of AtMT/pCeg colonies was higher than that of AtMT/pCambia-egfp colonies. This result can provide useful information on the AtMT of B. bassiana, especially antibiotics susceptibility and promoter-dependant expression level.

The entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana is widely used in integrated pest management (IPM), however its successful application is often limited by the little effort to explore its functions of unknown genes. In this work, egfp-expression cassette was randomly integrated into B. bassiana using Agrobacterium tumefaciensmediated transformation, and the general features of the mutants with unusual characteristics and the localization of the integrated genes were explored. To construct a transformation vector, egfp-expression cassette including gpdA promoter and trpC terminator was cut from pBARKS1-egfp using SacI and HindIII and integrated into pCAMBIA containing hygromycin B resistant hygR gene, designated as pCAMBIA-egfp. Transformed B. bassiana isolates were grown on quarter strength-Sabouraud dextrose agar containing 150 μg hygromycinB ml-1. Expression of egfp was investigated by RT-PCR and a fluorescent microscope (400×). Through the genome walking of the transformants using adaptor primers and gene specific primers, unique bands were detected on the egfp-expressing transformants, which were sequenced to figure out the flanking regions. This work provides a platform of methodology to figure out unknown functional genes of B .bassiana and possibly suggest an improved strategy to use the entomopathogen in IPM.

Enhanced green fluoresce protein gene (egfp) was expressed in Beauveria bassiana ERL836 based on the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AtMT) method in this study. The ERL836 transformants were generated with pCambia-egfp binary vector. Ten transformants were randomly selected and analyzed for the T-DNA insertion and gene expression. The results revealed that 60% of the fungal putative transformants were inserted by the T-DNA fragment. Of these transformants, 33.33% (2 transformants) expressed the egfp gene. The egfp transformants showed strong green fluorescence with different expression levels. The results of this study could provide a reference for foreign protein expression in B. bassiana by using the AtMT method.

Agrobacterium tumefaciens causes crown gall disease by transferring its DNA into host plants. Although Agrobacterium can be popularly used for genetic engineering, above-ground insect infestation in Agrobacterium gall formation has not been investigated. Nicotiana benthamiana leaves were exposed to a sucking insect whitefly infestation and a chemical trigger, benzothiadiazole (BTH), for 7 days, and these exposed plants were inoculated with Agrobacterium. We evaluated how whitefly infestation manipulated gall disease by Agrobacterium in planta and in vitro. Insect whitefly infested plants exhibited at least a 2-fold reduction in gall formation on both stem and crown root. Silencing isochorismate synthase 1 (ICS1), required for salicylic acid synthesis, compromised gall formation, indicating an involvement of salicylic acid in whitefly-derived plant defense against Agrobacterium. Endogenous salicylic acid content was augmented in whitefly-infested plants by Agrobacterium inoculation. However, infestation with whitefly did not alter Agrobacterium root colonization but reduced expression levels of genes involved in Agrobacterium virulence and transformation efficiency. Above-ground whitefly infestation therefore elicits systemic responses throughout the plant. Our findings provide new insights into insect-mediated leaf-root intra-communication and a framework to understand a general principle in multitrophic interactions in nature.

Alfalfa (Medicago sativa L.) is one of the most important forage legumes in the world. It has been demanded to establish the efficient transformation system in commercial varieties of alfalfa for forage molecular breeding and production of varieties possessing new characteristics. To approach this, genetic transformation techniques have been developed and modified. This work was performed to establish conditions for effective transformation of commercial alfalfa cultivars, Xinjiang Daye, ABT405, Vernal, Wintergreen and Alfagraze. GUS gene was used as a transgene and cotyledon and hypocotyl as a source of explants. Transformation efficiencies differed from 0 to 7.9% among alfalfa cultivars. Highest transformation efficiencies were observed in the cultivar Xinjiang Daye. The integration and expression of the transgenes in the transformed alfalfa plants was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and histochemical GUS assay. These data demonstrate highly efficient Agrobacterium transformation of diverse alfalfa cultivars Xinjiang Daye, which enables routine production of transgenic alfalfa plants.

Wounding to the mycelia of five mushroom species caused them to be susceptible to Agrobacterium-mediated transformation. The high transformation rate indicated that the wounds generated by mechanical means were a highly conclusive for agroinfiltration. Some transformants of Ganoderma lucidum were distinctive from the wild type in their morphology and antioxidative activity.

심비디움과 팔레놉시스의 형질전환 효율이 본 연구에서 비교되었 는데, 이를 위해 선발유전자로 PPT(Phosphinothricin) 제초제 저항 성인 bar 유전자가 사용되었고, 도입된 노화지연 유전자인ORE 7은 잎과 꽃에서 노화를 지연시켜 주며, 또한 개화 수를 늘려주는 형질 전환 식물체 개발에 이용될 것이다. 형질전환 방법 비교실험에서 심 비디움과 팔레놉시스 모두 아그로박테리움 방법이 유전자총 방법보 다 높은 효율을 보여 주었다. 또한 전반적으로 심비디움의 형질전환 효율이 팔레놉시스의 효율보다 높았음이 관찰되었다. 아그로박테리움 접종 전에 유전자총으로 미리 물리적 상처를 주어 접종효율은 높여 궁극적으로 형질전환 효율을 높이고자 수행한 실험에서는 오히려 무 처리구보다 더 낮은 형질전환 효율을 관찰하였다. 아그로박테리움 감 염 전 건조처리를 통한 형질전환 효율향상 실험에서는 심비디움의 경우 45분이 20%의 형질전환 효율로서 효율이 10% 미만인 대조 구보다 우수하였고, 팔레놉시스는 60분 건조처리가 가장 우수하였다. 형질전환 개체들의 PCR 분석을 통해 노화지연유전자ORE7이 도입 되었음을 확인하였고, real-time PCR 검정을 통해 도입된 형질전 환 유전자 copies를 확인하였다. 그결과, 전체 24개의 분석된 형질 전환 개체 중 심비디움 15개체 중 8 개체가 1 copy를 가지고 있 었고 나머지 7 개체는 2-3 copies를 가지고 있었다. 팔레놉시스는 오직 1개체만 1 copy 였고, 나머지 8개체는 2 copies 이상의 유 전자가 도입되었다. 본 연구에서 개선된 형질전환 체계는 앞으로 심 비디움과 팔레놉시스 형질전환 체계를 효과적으로 확립하는데 응용 될 것이라 판단된다.

포장에서 생육된 잔디 포복경을 이용한 Agrobacterium 형질전환에 있어서 큰 제한인자였던 곰팡이 오염을 제거할목적으로 포복경 조직에 대한 새로운 살균법을 개발하고자하였다. 여러 가지 살균방법 중에서 30% NaOCl로 15분간처리한 다음 0.1% HgCl2로 25분간 처리 했을 때 포복경절편체의 생존율이 높았으며, 0.1% HgCl2로 처리시 800mbar의 진공처리를 5분간 실시했을 때 가장 효과적이었다.또한 Agrobacterium과 공동배양 시 2.5 mg/l의 amphotericinB를 첨가해 준 배지에서 배양했을 때 가장 높은 생존율을나타내었다. AmB의 처리는 Agrobacterium의 생장에 영향을 미치지 않았다. 또한 살균된 포복경으로 부터 신초의재분화에도 영향을 미치지 않았으며 곰팡이 오염만을 효율적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 포장에서 대량으로 생육시킨 잔디 포복경을 이용한 Agrobacterium형질전환 시 그 효율을 증가시키는데 큰 기여를 할 것으로추측된다.

Agrobacterium tumefaciens mediated transformation(ATMT)은 Agrobacterium을 매개로 한 형질전환 방법으로 A. tumefaciens가 기주세포에 자신의 유전자를 삽입하는 특성을 이용한 것이다. 이 방법을 사용하여 팽이버섯의 단핵균주와 이핵균주에 대하여 형질전환변이체를 효율적으로 만들 수 있음을 이전 보고에서 보고한 바 있다. 그러나 이들 변이체의 형태적 변이는 일부 밖에 얻을 수 없었다. 이 것은 단핵균주 변이체의 경우 이핵균주에 비하여 자실체가 잘 형성이 되지 않아 교잡으로 이핵균주를 만들어야 하고, 이핵 균주 변이체의 경우 변이가 상보적인 핵에 감추어져 표현형으로 발현이 힘들었기 때문으로 생각되었다. 따라서 변이균주의 자실체 표현형 분석을 위한 단핵임성 균주 개발이 필요했다. 본 연구에서는 Agrobacterium을 매개로 한 형질전환 방법으로 단핵임성 균주를 육성하기 위하여 새로이 제작된 벡터를 사용하여 상보적인 교배형 유전자를 화합성 단핵균주인 4019-18(KACC 43777)에 형질전환하였다. 교배형 유전자를 포함하는 벡터로는 pGII Carb, pGII Nour가 사용되었고, 그리고 control 벡터 pBGgHg가 사용되었다. pGreenII Carb은 느타리버섯의 promoter와 terminator로부터 carboxin resistance cassette가져 왔고, pGreenII Nour은 치마버섯 GPD promoter와 SC3 terminator 시퀀스로부터 Nourseothricin resistance cassette(nat1 gene from Streptomyces noursei)를 가져 왔다. 이 벡터들은 각각 Carboxin(15㎍/mL), Noureseothricin(20㎍/mL), Hygromycin(30㎍/mL)에 저항성을 가지고 있어 이 항생제들에 의해 selection된다. 교배형 유전자 중 Homeodomain 유전자인 FvHD2-1, FvHD2-2 와 Pheromone receptor FvSTE3.1를 클로닝하여 교배형벡터를 작성하였다. 이 연구를 통해 단핵임성균주를 선발함으로써 유용유전자의 기능을 확인하는데 시간을 단축시킬 것으로 예상한다.

Trichoderma harzianum 균사체를 Al2O3 입자와 마찰시킴으로써 Agrobacterium을 이용한 형질전환 에 효과적으로 이용할 수 있었다. Hygromycin 저항성 균사체 출현을 비교한 결과 형질전환 효율이 20% 정도로 나타났으며 대조군의 경우 형질전환균사체의 출현은 없었다. 2차례의 연속적인 항생제배지에서 선발을 거친 형질전환균사체들은 PCR에 의하여 안정적 DNA도입이 확인되었으며 RT-PCR에 의하여 target gene의 mRNA발현을 확인할 수 있었다. 현재까지 Agrobacterium을 이용한 T. harzianum 형질 전환은 보고된 바 없다.

Gene manipulation of Siberian wildrye grass through transgenic technology can modify grass feature for further improvement in the forage production. In order to optimize transformation conditions of Siberian wildrye grass, the effects of transformation efficiency was investigated with GUS gene. Seed-derived calli were infected and co-cultured with Agrobacterium tumefaciens carrying the binary vector pCAMBIA3301 encoding the GUS gene in the T-DNA region. The effects of several factors on transformation and the expression of the GUS gene were investigated. The highest transformation efficiency was obtained when embryogenic calli were inoculated with Agrobacterium strain EHA101 in the presence of 200 μM acetosyringone and coculture for 5 days. The present study was framed and materialized to standardize an efficient, high frequency and reproducible genetic transformation protocol for aromatic Siberian wildrye grass using Agrobacterium tumefaciens.

난지형 사료작물들의 신품종 개발을 위해서는 형질전환기법에 의한 유용 유전자의 도입이 필수적이다. 기니아그라스를 포함하여 높은 조직배양 능력을 가진 3종의 Panicum속 식물을 대상으로 Agrobacterium법을 통한 효율적인 형질전환 체계를 확립하였다. P. meyerianum의 성숙종자 유래 캘러스를 이용하여 acetosyringone과 betaine이 Agrobacterium의 감염에 미치는 영향을 GUS 유전자의 발현 정도를 통해 조사하였다.

Trichoderma spp.는 white biotechnology에서 이용되는 대표적인 미생물로서 이들이 강력하게 분비 생산하는 효소들은 산업적으로 매우 중요하다. 본 연구에서는 amylase, pectinase, cellobiohydrolase 및 xylanase 분비활성이 높은 것으로 밝혀진 Trichoderma sp. KACC 40541균주에 대한 Agrobacterium이용 형질전환을 수행하였으며 균주개량을 위한 효율적인 유전자도입 방법을 제시하였 다. 특히 형질전환을 위하여서는 균사체에 대한 적정 농도의 NaOH처리가 매우 효과적임을 보여주었다.

본 연구에서는 국내에서 식용으로 재배되고 있는 팽이버섯의 균사체에 대하여 Agrobacterium을 이용한 형질전환을 시도하였다. 특히 물리적 연마제인 미세 aluminum oxide 입자를 팽이 균사체 와 함께 강하게 교반함으로써 물리적 상해를 지니는 균사체를 제조하였으며 감압침윤에 의한 Agrobacterium 이용 형질전환을 시도하였다. Hygromycin 저항성을 이용한 선발 결과, 대조군에 서는 균사체 생육이 전혀 관찰되지 않은 반면 물리적 상해군에서는 형질전환균사체 생육이 확인되 었다. Genomic DNA PCR에 의한 유전자 도입을 확인함으로써 팽이균사체에 대한 매우 간편한 형 질전환법을 제시할 수 있었다.