This study tested a hypothesis that the bacterial immunosuppresants enhance BtI susceptibility of two mosquitoes, the forest mosquito (Aedes albopictus) and the house mosquito (Culex pipiens pallens). Three symbiotic bacteria Xenorhabdus nematophila (Xn), X. hominickii (Xh), and Photorhabdus temperata subsp. temperata (Ptt) were isolated from their symbiotic nematodes and cultured in nutrient broth to allow them to produce the secondary metabolites. BtI gave significant toxicities to A. albopictus and C. pipiens pallens larvae: 50% of lethal concentration to be 2.9 × 105 spores/mL and 2.2 × 105 spores/mL at 16 h after treatment, respectively. Addition of each bacteria-cultured broth significantly enhanced BtI toxicity to the mosquito larvae by lowering LC50 values of BtI to A. albopictus larvae (1.5 × 105 to Xn, 1.7 × 105 to Xh, and 1.9 × 105 to Ptt, respectively) and to C. pipiens pallens larvae (1.2 × 105 to Xn, 1.3 × 105 to Xh, and 1.5 × 105 to Ptt, respectively). Based on these results, we developed a new mosquitocidal Bt formulation called ‘Dip-Kill’, which consisted of 80% Xn-cultured broth, 10% BtI (1010 spores/mL), and 10% preservative. Only 400 ppm of Dip-Kill showed 100% mortality to fourth instar larvae of A. albopictus and C. pipiens pallens 16 h after treatment.

Bacillus thuringiensis subsp. aizawai KB098 (이하 KB098 균주)은 파밤나방에 높은 살충 활성을 보인다. 해충에 살충 활성을 나타내는 내독소 단백질은 cry gene에 의해 발현이 되는데 cry gene은 주로 Bacillus thuringiensis의 plasmid DNA 상에 존재한다. KB098의 plasmid DNA를 추출하여 PCR을 수행한 결과, Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C, Cry1D 총 4개의 cry gene을 가지고 있는 것으로 확인되었다. KBM-1은 KB098균주를 curing한 mutant 균주로, KB098균주를 42℃조건에서 48시간 배양하고, UV를 조사하여 확보하였다. KBM-1의 plasmid DNA를 PCR한 결과 KB098에서처럼 Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C, Cry1D의 cry gene이 증폭됨을 알 수 있었다. KBM-1은 KB098처럼 crystal을 암호화하는 plasmid DNA를 가지며, cry gene을 보유하고 있다. 반면 KB098과는 달리 KBM-1 균주는 내독소 단백질을 생성하지 못하며 파밤나방의 생물 활성 검정에서 독성을 나타내지 않았다. 이러한 원인을 밝히고자 KBM-1 plasmid DNA의 특정 cry gene의 PCR 결과, 증폭된 cry 유전자 내에서 염기서열의 변화에 기인할 것이란 가정하에, KB098과 KBM-1 균주의 특정 plasmid DNA 상에서 증폭된 cry gene의 염기서열을 비교분석 할 것이다. 이를 통해 crystal 형성에 관여하는 유전자의 변이 유무를 확인할 계획이다.

Bacillus thuringiensis (Bt) is characterized by its ability to synthesize crystal toxins and also able to produce bacteriocins such as thuricin, tochicin, entomocin and bacthuricin. The present work, for the first time, describes the biological activity of bacteriocins from B. thuringiensis subsp. cameroun (Btc). Supernatant which was produced from a liquid culture of Btc had antimicrobial activity against various Bt subspecies, ending up to making a inhibition zone on an agar medium. A significant reduction in antimicrobial activity was observed when the supernatant was exposed to heat at 47~50°C for 15 min. Proteins were separated from the supernatant by a fast protein liquid chromatography (FPLC) given the thermal instability. A group of FPLC fractions had antimicrobial activity against Bt subsp. palmanyolensis, israelensis, 1-3, morrisoni, toguchini and kurstaki and a Bacillus. cereus ATCC21768, ATCC14579 and NRRLB-569. Interestingly, when the supernatant was individually incorporated into the liquid cultures of Bt subsp. israelensis (Bti) and mogi (Btm) with mosquitocidal activity, a vegetative cell growth was observed only in the Btm culture 10 h post-incubation. A possible recovery of vegetative Btm cell growth was observed, compared to a control without the supernatant. These results suggest that Btc produced proteinous antimicrobial substances, one of which may be used as a selection marker to separate Btm after possibly conjugating the two mosquitocidal strains.

Bacillus thuringiensis(B.t.)에서 cry gene은 plasmid DNA상에 존재하고 대상 곤충에 살충활성을 나타내는 내독소단백질 형성에 관여하는 주요 유전자이다.파밤나방(spodoptera exigua)에 높은 살충활성을 보이는 B.t. subsp. aizawai KB098 균주의 cry gene이 위치하는 plasmid DNA를 찾기 위해 curing 방법을 사용하였다. KB098균주는 cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D 4개의 cry gene을 가지고 있으며, Plasmid DNA는 7개가 확인되었다. Cry gene을 암호화하는 plasmid DNA를 찾기 위한 curing 방법은 LB배지에 KB098균주를 희석 후, 27℃ 진탕배양기에서 24시간 배양한 뒤 NA배지에 spreading 한 후, 42℃조건으로 48시간 배양하여 단일 colony를 얻었다. 위상차현미경으로 관찰했을 때 내독소단백질을 형성하지 않는 colony를 NA배지에 streaking하여 27℃ 조건으로 4일간 배양하였다. 위상차현미경관찰을 통해 내독소단백질을 형성하지 않는 colony를 선발하였다. Curing과정이 제대로 수행되었는지 확인하기 위해 SDS-PAGE를 통하여 분자량 130kDa의 내독소단백질 band가 형성되지 않음을 확인하였으며, PCR증폭을 통해 acrystalliferous균주가 KB098 균주가 가지고 있는 4개의 cry gene을 가지고 있지 않음을 확인하였다. cry gene을 암호화 하는 plasmid DNA를 찾기 위해 KB098균주와 5개의 acrystalliferous균주와의 plasmid DNA pattern을 비교하였다. acrystalliferous균주에서 결실된 plasmid DNA만을 gel elution 한 후에 PCR을 통해 cry gene의 존재를 확인하였다.

Tannic acid가 파밤나방의 중장액에 존재하는 단백질분해효소의 활성을 저해함으로 처리된 Bacillus thuringiensis(이하 B. thuringiensis) subsp. kurstaki KB100균주의 insecticidal crystal proteins(ICPs)의 과분해를 억제하며 살충활성을 상승시키는 효과가 있다는 연구결과를 기초로, tannic acid의 protease inhibition여부 및 tannic acid가 B. thuringiensis KB100균주의 parasporal inclusion에 미치는 영향을 조사하였다. Tannic acid와 파밤나방 중장액을 먼저 혼합하여 반응시킨 후 B. thuringiensis KB100의 parasporal inclusion에 처리하여 SDS-PAGE를 통해 단백질밴드를 확인한 결과, 중장액내의 단백질분해효소에 의해 정상적으로 분해되어 60KDa의 살충활성을 나타내는 독소단백질 밴드를 나타냈다. 따라서 tannic acid에 의한 살충활성증대의 정확한 영향을 확인하기 위해, B. thuringiensis의 parasporal inclusion과 먼저 혼합하여 반응시킨 후 파밤나방 중장액을 처리하고 단백질 밴드패턴을 확인한 결과 전독소인 130kDa의 단백질이 거의 분해되지 않고 나타났다. B. thuringiensis KB100의 parasporal inclusion과 tannic acid을 먼저 혼합하여 반응시킨 것을 위상차현미경하에서 확인한 결과, tannic acid의 농도가 높아질수록 parasporal inclusion이 응집하여 있는 것이 확인되어, tannic acid가 파밤나방 중장 내 소화효소에 반응하는 영향보다 B. thuringiensis 독소단백질의 응집을 통해 소화효소의 분해저해 원인 가능성을 확인하였다.

Bacillus thuringiensis (Bt) is characterized by its ability to synthesize crystal toxins and also able to produce bacteriocins such as thuricin, tochicin, entomocin and bacthuricin. The present work, for the first time, describes the biological activity of bacteriocins from B. thuringiensis subsp. cameroun (Btc). Supernatant which was produced from a liquid culture of Btc had antimicrobial activity against Bacillus cereus, ending up to making a inhibition zone on an agar medium. A significant reduction in antimicrobial activity was observed when the supernatant was exposed to heat at 75~100°C for 15 min. Proteins were separated from the supernatant by a fast protein liquid chromatography (FPLC) given the thermal instability. A group of FPLC fractions had antimicrobial activity against Bt subsp. palmanyolensis, israelensis, 1-3, morrisoni, toguchini and kurstaki, and B. cereus ACTC21768, ATCC14579 and NRRLB-569. Interestingly, when the supernatant was individually incorporated into the liquid cultures of Bt subsp. israelensis (Bti) and mogi (Btm) with mosquitocidal activity, a vegetative cell growth was observed only in the Btm culture 10 h post-incubation. A possible recovery of vegetative Btm cell growth was observed, compared to a control without the supernatant. These results suggest that Btc produced proteinous antimicrobial substances, one of which may be used as a selection marker to separate Btm after possibly conjugating the two mosquitocidal strains.

cry gene은 Bacillus thuringienesis(B.t.)에서 대상 곤충에 살충활성을 나타내는 내독소단백질을 형성하는 주요 유전자로 특정 plasmid DNA상에 암호화되어 있 다. B.t. subsp. aizawai KB098 균주는 파밤나방(spodoptera exigua)에 높은 살충 활성을 보이는 균주로 본 연구에서는 이 균주의 cry gene이 위치하는 plasmid DNA를 찾고자 하였다. 본 실험에 이용된 KB098균주는 cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D 4개의 cry gene을 가지고 있으며, Plasmid DNA는 7개가 확인되었다. Cry gene을 암호화하는 plasmid DNA를 찾기 위해 acrystalliferous균주가 필요하였으 며, 42℃조건으로 48시간 열처리 후 새로운 배지에 27℃ 조건으로 3일간 재배양 하여 sporulation단계에서 위상차현미경관찰을 통해 내독소단백질을 형성하지 않 는 colony를 autolysis 단계까지 배양한 후에 위상차현미경으로 재확인하여 확보 할 수 있었다. 획득한 14개의 acrystalliferous를 균주 중, 서로 다른 pattern의 plasmid DNA를 갖는 5개의 균주를 선발하였고, acrystalliferous재확인을 하기 위 해 SDS-PAGE를 통하여 내독소단백질의 분자량인 130kDa의 band가 형성되지 않음을 확인하였으며, PCR증폭을 통해 acrystalliferous균주가 KB098 균주가 가 지고 있는 4개의 cry gene을 가지고 있지 않음을 확인하였다. cry gene을 암호화 하는 plasmid DNA를 찾기 위해 KB098균주와 선발한 5개의 균주와의 plasmid DNA pattern을 비교한 결과, 두 개의 plasmid DNA band에서의 차이가 확인되 었다.

해충에 대한 화학농약의 오남용으로 인하여 해충의 저항성이 발달되고 환경오염, 인축에 대한 위험 등의 이유로 화학농약의 사용을 줄이게 되었다. 그래서 친환경적인 방제인자인 미생물농약 Bacillus thuringiensis(이하 B.t)가 현재 전 세계적으로 널리 사용되고 있다. B.t는 그람 양성의 호기성 간균으로 토양, 곡물의 분진, 낙엽, 곤충의 사체 등 다양한 곳에서 분리되는 것으로 알려져 있는데, 본 연구에서는 풍뎅이류 곤충의 사체로부터 분리한 B.t subsp. kurstaki CAB530 균주가 나비목 해충에 대해서 살충활성을 나타내는 것을 확인하였으며, 특히 난방제 해충인 파밤나방에 살충활성이 뛰어난 KB099 균주와 비교하기 위하여 SDS-PAGE와 PCR을 수행하였다. 파밤나방에 대한 생물활성 검정 결과, CAB530 균주는 처리 48시간 후에 90%가 넘는 사충률을 보여주었며, 다른 B.t subsp. kurstaki SDS-PAGE 수행 결과 파밤나방에 살충활성이 있는 B.t subsp. kurstaki와 비슷한 130kDa의 밴드를 나타내었다. 또한 파밤나방 중장액으로 소화를 시킨 후에 약 65kDa의 활성독소를 확인할 수 있었다. 파밤나방에 6%의 사충율을 보이며 낮은 살충활성을 보인 CAB533 균주는 65kDa의 독소단백질 밴드를 나타냈지만 파밤나방에 대해서 살충활성이 높지는 않았다. PCR수행 결과 파밤나방에 대해서 가장 활성이 높은 CAB530 균주는 Cry1Aa, 1Ab, 1Ac, 1B, 1D, 1E, 1F, 1I, Cry2 유전자가 존재하는 것으로 밝혀졌다.

Among 18 Bacillus thuringiensis isolates with spherical parasporal inclusion from soils, B. thuringiensis subsp. israelensis CAB199 was selected. It was showing over 90% mortality against Aedes aegypti and Culex pipiens moletus. It was confirmed that this B. thuringiensis subsp. israelensis CAB199 isolate also had a insecticidal activity against Culex inatomii that was occurred in the marsh. Because most of mosquito larva were primarily situated or shifted from under- to surface water, we need to select long floating formulations on surface water for controlling mosquito larva. It was tested the pesticidal and control effects in the laboratory and wetland with two formulation types of B. thuringiensis subsp. israelensis, for example, wettable power (WP) and suspension concentrate type (SC). Laboratory test showed that SC formulation type was relatively faster and more effective against 3 tested mosquito species, C. pipiens, Aedes aegypti, and C. inatomii. Otherwise, the control efficacy of SC formulation type was more rapidly appeared against C. inatomii in the wetland.

파리목 모기과에 속하는 모기는 인간에게 질병을 매개하는 위생해충으로 세대기간이 짧으며, 번식력이 강한 특성을 가지고 있다. 인간에게 피해를 주는 모기에 대한 국내의 모기 방제는 대부분 성충을 대상으로 분무식 화학농약을 처리하였으나성충의 휴식 및 행동습성 그리고 정확한 서식처에 직접 접촉을 해야 방제효과를 얻을 수 있다는 점에서 방제에 어려움이 있다. 본 연구에서는 피해의 본질적인 원인이 되는 모기 유충을 대상으로 곤충 살충성 단백질을 생성하는 Bacillus thuringiensis(이하Bt)균주를 선발하여 친환경적인 모기 방제에 대한 실험을 수행하였다. 국내의 토양에서 Spherical type의 Crystal을 형성하는 19개 균주를 위상차 현미경으로 확인 후 모기에 가장 높은 활성을 보인 B.thuringiensis subsp. israelensis CAB191균주를 선발 대량배양하였다., 생물검정은 현재 시판중인 B.t.i 약제(B제품) 와 에스메토프렌을 주성분으로 하는 천연 식물성 테르페노이드 화합물인 약제(A제품)를 대조구로 사용하였다. 대상 해충은 이집트숲모기(Aedes aegypti), 이나도미집모기 (Culex inatomii), 지하집모기(Culex pipiens molestus)의 3령 유충으로 생물 검정을 수행하였다. CAB191균주와 B제품은 103cfu/ml에서 이집트숲모기, 이나도미집모기, 지하집모기에 90%이상의 높은 사충률을 보였다. 반면 A제품은 1,000배 희석액에서 48시간 후 검정시 10%정도의 사충률을 보였다. 이로써 CAB191균주와 B제품이 활성이 높음을 알 수 있었다. 또한 B.t.i와 B제품, CAB191, 대조 균주로 B.t.morrisoni의 단백질 패턴을 분석하기 위하여 SDS-PAGE한 결과 CAB191, B제품이 B.t.i와 동일한 130, 72, 27KDa의 밴드를 형성함을 알 수 있었다.

Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki KB100 isolated from the domestic soil have the most effective activity against the beet armyworm, Spodoptera exigua larva. The tannic acid as protease inhibitor might be increased the efficacy of sublethal concentrations of B. thuringiensis. The tannic acid was identified as a protease inhibitor that could increased the efficacy of sublethal concentrations of B. thuringiensis. Mixture of B. thuringiensis and tannic acid was investigated the mortality of S. exigua larva in the laboratory and field. When B. thuringiensis treated to 2nd larva of S. exigua, mortality was shown 54.4%. However, mixtures of B. thuringiensis with 4 and 40 mM tannic acid were increased mortalities to 2nd larva of S. exigua as 64.0 and 95.5%, respectively. Also, synergy effect of mixture of B. thuringiensis and 40 mM tannic acid was increased the mortality of S. exigua 3rd larva to 93.3%, even though 60.0% mortality with only B. thuringiensis treatment. On the other hand, the mortality of mixture with B. thuringiensis and 80 mM tannic acid was 53.3% lower than B. thuringiensis single treatment. In the welsh onion field, the accumulated mortalities of 3 times replicated with mixture of B. thuringiensis and 40 mM tannic acid were 83.9, 89.4 and 66.8% compare with 61.8, 80.4 and 47.3% as only B. thuringiensis treatment, respectively.

Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109 isolated in Korea is known active against Spodoptera sp.. Especially, B. thuringiensis aizawai CAB109 isolates showed 100% mortality against Spodoptera litura and Spodoptera exigua. To screen highly active B. thuringiensis, the pathogenicity of B. thuringiensis CAB109 was compared with that of commercialized B. thuringiensis products. LC₅₀ values of CAB109, product TB-WP and product SC strains of B. thuringiensis were 1.3x10⁵, 2.3x10⁶ and 5.2x10⁵ cfu/㎖ against the 2nd larva of S. litura and 1.8×10⁴, 1.3×10⁶ and 1.5×10⁶ cfu/㎖ against the 2nd larva S. exigua, respectively. To determine new gene"s existence and absence, the plasmid DNA was extracted, and compared to that of B.t. aizawai HD-133. Both B. thuringiensis were not like plasmid DNA pattern. PCR technique was used to predict both plasmid DNA"s cry gene. PCR products analysis showed that B.t. CAB109 harbor Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C and Cry1D and B.t. HD-133 has Cry1Aa and Cry1Ab, respectively.

파밤나방은 파, 배추, 수박 등에 다 발생하여 큰 피해를 주는 대표적인 농업 해충이며 화학농약에 대한 저항성이 강한 대표적인 해충으로, 본 연구에서는 생물적 방제인자로 방제하고자 Bacillus thuringiensis(이하 Bt) 균주를 선발하여 살충효과를 검정 하였다. 파밤나방의 살충효과검정에서 내성이 강한 해충과 비슷한 양상으로, 나비목 해충과 다르게 Bt에 대한 살충활성이 늦게 나타나는 지효성을 나타냈다. 이러한 원인으로 유충 중장 프로테아제에 의해 Bt의 cry 독소가 과분해 되는 것으로 가정하고 protein inhibitor로 알려져 있는 tannic acid를 선발하여 실내 실험과 야외 포장 실험을 수행하였다. 그 결과 Bt 단독처리보다 Bt와 tannic acid를 혼합처리 했을 때 더 높은 사충율을 나타냈다. 이 같은 결과에 대해 원인을 규명하고자, 가설을 세워 실험을 수행 하였다. 중장 프로테아제가 130kDa의 불활성 독소를 60kDa의 활성 독소로 분해한 후, 더 과분해 하는 것을 tannic acid가 억제할 것이다 라고 가설을 세운 후 실험을 수행 하였다. SDS-PAGE를 하여 tannic acid의 억제정도를 확인했고, 이 결과를 토대로 40mM tannic acid를 전 처리 한 후 Bt처리를 한 결과 동시처리보다 약 5% 더 높은 사충율을 나타냈다. Bt와 중장 프로테아제, tannic acid의 반응에 있어서 형태적인 면을 확인하기 위해 전자현미경을 관찰 하였다. 중장 프로테아제의 증명을 위해 자이모그램 실험을 수행 하였다.

국내에서 분리된 Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109균주는 나비목 해충에 활성을 보이는 것을 확인 하였다. 특히 우리나라에서 난방제 해충으로 알려진 담배거세미나방과 파밤나방에 동시에 독성을 보이는 것으로 나타났다. B.t. CAB109 균주의 활성정도를 비교하기 위해 혈청형이 aizawai이면서 생물농약으로 시판중인 T제품과 S제품을 조사한 결과, B.t. CAB109, T제품, S제품은 담배거세미나방 2령충에 대한 반수치사농도(LD50)가 각각 1.3x105cfu/ml, 2.3x106cfu/ml, 5.2x105cfu/ml으로 나타났고 파밤나방 2령충에 대한 반수치사농도는 1.8x104cfu/ml, 1.3x106cfu/ml, 1.5x106cfu/ml으로 나타나 두 종 해충 모두에서 B.t. CAB109 균주가 독성이 더 높은 것을 볼 수 있었다. B.t. CAB109가 이미 알려져 있는 aizawai와 비교해 새로운 유전자를 소유하는지 확인하기 위해 Plasmid DNA를 추출하여 전기영동 한 결과 B.t. subsp. aizawai HD-133과 다른 패턴을 보이는 것을 확인 할 수 있었고 Cry1~Cry5의 primer를 사용하여 PCR을 진행한 결과 B.t. subsp. aizawai CAB109균주는 Cry1Aa, 1Ab, 1C, 1D를 B.t. subsp. aizawai HD-133은 Cry1Aa, 1Ab를 가지고 있음을 확인 할 수 있었다. Plasmid DNA의 여러 밴드에서 어떤 부분이 해충에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 B.t.가 생장하기 어려운 조건을 만들어 배양한 결과 이전과 다른 B.t. 내독소단백질을 가지고 있지 않은 strain을 만들 수 있었다. 이두 CAB109 strain의 플라스미드 DNA를 확인한 결과 밴드의 차이를 확인할 수 있었다. 그리고 Cry- strain은 모 stain이 가지고 있는 Cry gene을 가지고 있지 않음을 확인 할 수 있었고 생물 활성결과 독성을 보이지 않음을 확인하였다. 이후 다른 B.t. CAB109가 다른 Cry gene을 가지고 있는지에 대한 PCR을 더 진행할 예정이며 새로운 Cry gene여부에 대한 연구도 더 진행해나갈 계획이다.

Bacillus thuringiensis, an entomopathogenic bacterium belonging to the B. cereus group, harbors numerous extra-chromosomal DNA molecules whose sizes range from 2 to 250 kb. In this study, we used a plasmid capture system (PCS) to clone three small plasmids from B. thuringiensis subsp. kurstaki K1 using PCS which were not found in B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, and determined the complete nucleotide sequence of plasmid pK1S-1 (5.5 kb). Of the six putative open reading frames (ORF2-ORF7) in pK1S-1, ORF2 (MobK1) showed approximately 90% aa identity with the Mob-proteins of pGI2 and pTX14-2, which are rolling circle replicating group VII (RCR group VII) plasmids from B. thuringiensis. In addition, a putative origin of transfer (oriT) showed 95.8% identity with those of pGI2 and pTX14-2. ORF3 (RepK1) showed relatively low aa identity (17.8-25.2%) with the Rep protein coded by RCR plasmids, however. The putative double-strand origin of replication (dso) and single-strand origin of replication (sso) of pK1S-1 exhibited approximately 70% and 64% identities with those of pGI2 and pTX14-2. ORF6 and 7 showed greater than 50% similarities with alkaline serine protease, which belongs to the subtilase family. The other 2 ORFs were identified as hypothetical proteins. To determine the replicon of pK1S-1, seven subclones were contructed in the B. t huringiensis ori-negative pHT1K vector and were electroporated into a plasmid cured B. thuringiensis strain. The 1.6 kb region that included the putative ORF3 (Rep1K), dso and ORF4, exhibited replication ability. These findings identified pK1S-1 as a new RCR group VII plasmid, and determined its replication region.

분리된 Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109균주는 나비목 해충에 활 성을 보이는 것을 확인 하였는데 특히 우리나라에서 난방제 해충으로 알려진 담배거세미나방과 파밤나방에 동시에 독성을 보이는 것으로 나타났다. B.t. CAB109 균주의 활성정도를 비교하기 위해 혈청형이 aizawai이면서 생물농약 으로 시판중인 T제품과 S제품을 조사한 결과, B.t. CAB109, T제품, S제품은 담배거세미나방2령충에 대한 반수치사농도가 각각 1.3×105cfu/ml, 2.3×106cfu/ml, 5.2×105cfu/ml으로 나타났고 파밤나방2령충에 대한 반수치사농도는 1.8×104cfu/ml, 1.3×106cfu/ml, 1.5×106cfu/ml으로 나타나 두 종 해충 모두에서 B.t. CAB109 균 주가 독성이 더 높은 것을 볼 수 있었다. B.t. CAB109가 이미 알려져 있는 aizawai와 비교해 새로운 유전자를 소유하 는지 확인하기 위해 Plasmid DNA를 추출하여 전기영동 한 결과 B.t. subsp. aizawai HD-133과 다른 패턴을 보이는 것을 확인 할 수 있었고 Cry1-Cry5의 primer를 사용하여 PCR을 진행한 결과 B.t. subsp. aizawai CAB109균주는 Cry1Aa, 1Ab, 1C, 1D를 B.t. subsp. aizawai HD-133은 Cry1Aa, 1Ab를 가지고 있음을 확 인 할 수 있었다. 이후 다른 B.t. CAB109가 다른 Cry gene을 가지고 있는지에 대한 PCR을 더 진행할 예정이며 새로운 Cry gene여부에 대한 연구도 더 진행해나갈 계획이다

파밤나방은 파, 배추, 수박 등에 다발생하여 큰 피해를 주는 대표적인 농업 해충이며 화학농약에 대한 저항성이 강한 대표적인 해충으로, 본 연구에서는 생물적 방제인자로 방제하고자 Bacillus thuringiensis(이하 Bt) 균주를 선발하여 살충효과를 검정 하였다. 파밤나방은 살충효과검정과정에서 내성이 강한 해충과 비슷한 양상으로, 다른 나비목 해충과 다르게 Bt에 대한 살충활성이 늦게 나타나는 지효성을 나타냈다. 이러한 원인으로 유충 중장의 프로테아제에 의해 cry 독소가 과분 해 되는 것으로 가정하고 protein inhibitor로 알려져 있는 tannic acid를 선발하 여 실내 실험과 야외 포장 실험을 수행하였다. 그 결과 Bt 단독처리보다 Bt와 tannic acid를 혼합처리 했을 때 더 높은 사충율을 나타냈다. 이 같은 결과에 대해 원인을 규명하고자, 몇 가지 가설을 세워 실험을 수행 하였다. 첫 번째 tannic acid가 Bt균 자체에 영향을 미치는 영향을 확인 하기 위해, Nutrient Agar(NA)배지에 tannic acid를 처리했을 때, Bt균의 생장여부와 생장정도를 확 인하고, 중장액과 Bt, tannaic acid를 각각 또는 혼합처리 했을 때의 중장내 Bt crystal의 형태적 변화를 관찰하기 위해 주사전자현미경 관찰을 수행 하였다. 두 번째로 중장 프로테아제가 130kDa의 불활성 독소를 60kDa의 활성독소로 분해한 후, 더 과분해 하는 것을 tannic acid가 억제할 것이라는 가설을 증명하 기 위해 SDS-PAGE를 수행하여 tannic acid의 억제정도를 확인했고, 이 결과를 토대로 40mM tannic acid를 전처리 한 후 Bt처리를 했을 때, 동시처리보다 약 5% 더 높은 사충율을 나타냈다.

Eight Bacillus thuringiensis strains activated against mosquito larva were compared their characterization. Spherical-shaped parasporal inclusion of B. thuringiensis subsp. tohokuensis CAB167 was observed by phase-contrast microscopy and scanning electron microscopy. LC₅₀ values of B. thuringiensis subsp. tohokuensis CAB167 against Culex pipiens molestus, Culex pipiens pallens, and Aedes aegyti were 173, 190 and 580 ng/㎖, respectively. B. thuringiensis subsp. tohokuensis CAB167 had a parasporal inclusion containing 4 major protein components, for example, 135, 80, 49 and 28-kDa by SDS-PAGE. Otherwise, after trypsin digestion of parasporal inclusion, SDS-PAGE was showed new protease-resistant peptides at 72 and 63-kDa. Activated toxins of isolated CAB167 were different from other reference strains on a serological by immuno-diffusion test.