식욕조절과 신진대사에 관여하는 것으로 알려진 nesfatin-1/NUCB2는 시상하부 이외에 지방조직, 소화기관 및 생식기관에서도 발현되는 것이 보고되었다. 본 연구실에서도 nesfatin-1/NUCB2의 발현을 전 장기에서 조사한 결과, 뇌하수체, 심장, 폐, 소화기관 및 생식기관에서 다량 발현하고 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 nesfatin-1/NUCB2가 체내 주요 장기의 발달 및 생리적 기능 조절에 관여할 가능성을 제시하고 있다. 이에 본 연구에서는 생쥐를 대상으로 배아에서 성체로 성장하는 동안 장기 내 nesfatin-1/NUCB2 발현 변화를 조사함으로써 nesfatin-1/NUCB2 발현과 장기의 발달과 어떤 연관성을 가지고 있는 지 알아보고자 하였다. 이를 위하여 생쥐 태자, 신생쥐, 성체 생쥐에서 성장에 따른 nesfatin-1/NUCB2의 발현 양상을 면역조직화학적 염색, qRT-PCR과 western blot 방법으로 조사하였다. 먼저 생쥐 태자에서 nesfatin-1/NUCB2 단백질 발현을 면역조직화학적 염색으로 확인한 결과, 뇌, 심장, 폐에서 다량 발현되는 것을 확인하였다. 또한, FITC-conjugated nesfatin-1을 이용하여 nesfatin-1 결합 부위를 확인한 결과에서도 nesfatin-1 발현 부위와 유사하게 뇌, 심장, 폐에서 염색되는 것을 확인할 수 있었다. qRT-PCR과 western blot 방법으로 신생쥐와 성체 생쥐 내 다양한 장기에서 nesfatin-1/NUCB2 발현량을 조사한 결과, 신생쥐에서는 다른 장기에 비해 심장과 폐에서 nesfatin-1/NUCB2 발현량이 높았으나, 성체로 성장하면서 발현량이 감소하는 경향을 보였다. 흥미롭게도 신생쥐의 신장에서는 nesfatin-1/NUCB2 발현이 거의 되지 않다가 성체가 되면서 다량 발현하는 양상을 보였다. 한편, 성체 생쥐의 신장에서 암컷과 수컷 사이의 nesfatin-1/NUCB2 발현 양상은 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 발생 초기에는 nesfatin-1/NUCB2의 발현이 신진대사에 필수적인 심장과 폐에서 많이 발현하고, 성장하면서 배설에 관여하는 신장에서 다량 발현하는 것으로 보아 nesfatin-1/NUCB2가 생쥐 성장 단계에서 특이적으로 장기의 발달과 생리적 기능을 조절할 수 있을 것으로 사료된다. 앞으로 심장, 폐 및 신장에서 다량으로 발현하고 있는 nesfatin-1/NUCB2가 어떤 기능을 가지고 있는 지 알아보기 위한 더 많은 연구가 요구된다.

체세포분열에서는 세포질 분열이 완성된 형태로 두 개의 독립적인 딸 세포가 형성되지만, 분열중인 생식세포들은 intercellular bridge를 통해 연결되어 있다. Centralspindlin complex의 구성성분 중 하나인 mitotic kinesin-like protein-1 (MKLP1)은 세포분열 중기 및 후기에 염색체 분열과 cytokinesis에 관여한다. 생식세포에서의 세포분열 후기단계에서 발현되는 testis-expressed gene 14(TEX14)는 kinetochore의 요소 중 하나로, 세포 후기 단계에 생성되는 intercellular bridge의 구성요소 중 하나이다. Aurora kinase B(ARKB)는 MKLP1을 인산화시켜 intercellular bridge를 안정화한다. 본 연구에서는 정소 내 생식세포의 증식과 감수분열, 정자형태형성 과정에서 ARKB에 의한 MKLP-1의 기능조절 연구의 일환으로 발생중인 생쥐 정소에서 MKLP1, ARKB, TEX14 발현을 분석하였다. 본 연구에서는 임신 19일째 배아, 출생 직후, 출생 후 1, 2, 4, 8주령의 수컷 생쥐의 정소를 대상으로 하였다. 정량적 RT-PCR법을 이용하여 정소 내 MKLP-1 mRNA 발현을 확인하였으며, Western blot을 이용하여 MKLP-1 단백질 발현을 확인하였다. 또한 면역조직화학법을 이용하여 정소 내 MKLP-1,ARKB, TEX-14의 발현을 확인하였다. Western blot 결과, 정소에서 110 kDa의 MKLP-1 단백질 발현을 확인하였다. 생후 2주령부터 MKLP-1 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였다. MKLP-1 immunoreactivity는 생후 1일 정소의 gonocytes, 생후 1주령 정소의 spermatogonia, 생후 2주령 정소의 early spermatocytes에서는 핵과 intercellular bridge에서 발현하였고, 생후 4주 및 8주령 정소의 pachytene spermatocytes 이후 단계의 생식세포들에서는 intercellular bridge에서 발현하였다. Sertoli cell과 Leydig cell 핵의인 부위에서도 발현하였다. ARKB는 pachytene spermatocyte의 핵과 intercellular bridge에서 강하게 발현하였다. TEX14 immunoreactivity는 생후 1일 정소에서 발현은 거의 되지 않았다. 생후 1주부터 성체시기까지 생식세포의 intercellular bridge에서 발현하였다. 정소 내에서 MKLP-1은 gonocytes, spermatogonia, 초기감수분열 중인 spermatocytes의 핵과 intercellular bridge에서 활성을 띄는 반면 pachytene spermatocyte 이후부터는 intercellular bridge 형성에 관여하는 것으로 사료된다. ARKB는 intercellular bridge에서 MKLP1의 안정화에 기여하지만 Pachytene spermatocyte stage 전후단계의 생식세포의 핵에서 MKLP1의 발현을 제한하는 상반된 역할을 하는 것으로 사료된다.

야행성 설치류의 섭식행동은 주로 밤 시간대에 일어난다. 본 연구는 섭식행동을 매개로 하는 일주기 패턴과 생식계의 상관관계 유무를 조사하고자 한 것이다. 이를 위해 수컷 생쥐를 대상으로 하여 섭식패턴을 강제로 역전시킨 뒤 각 4, 8, 12주 후 생식조직들에 미치는 영향을 조사하였다. 사용한 생후 4주인 수컷 생쥐(ICV strain)는 light:dark cycle을 12시간:12시간으로 설정한 사육실에서 식수의 접근이 자유로운 상태에서 사육하였다. 대조군과 실험군으로 나누어 대조군은 암기(19:00시부터 익일 08:00시)에만 먹이를 제공하고, 실험군은 명기(08:00시부터 19:00시)에만 먹이를 제공하였다. 4, 8, 12주 후 동물들을 희생시킨 후 생식조직과 장기들의 무게를 측정하였다. 섭식패턴역전을 시행한 결과, 체중은 4주 실험군에서 감소하는 경향을 보였으나 8주 실험군(p<0.05)에서 유의하게 감소하였으며, 12주 실험군에서는 큰 차이를 보이지 않았다. 생식기관인 정소와 부정소에서는 모든 실험군에서 유의한 차이를 나타내지 않았으나 저정낭은 대체로 감소하는 경향을 보였고, 4주차(p<0.01)에서 특히 유의하게 감소하였다. 또한 전립선은 4주, 8주 실험군에서는 대조군보다 높은 양상을 보였지만 점차 감소하여 12주차에서는 유의하지는 않으나 감소하는 경향을 보였다. 뇌하수체의 무게는 모든 실험군에서 대체로 감소하는 경향을 보였으나 유의하지는 않았다. 신장과 비장의 경우 4주차 실험군(각각 p<0.001, p<0.05)에서 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 부신의 경우 4주차(p<0.01)에서는 유의하게 감소하였으나 8주, 12주 실험군에서는 대조군과 비슷하게 회복되는 양상을 보였다. 본 연구는 빛/어둠 조절이 아닌 섭식행동 패턴을 역전시키는 간접적인 일주기 교란에 의해 수컷 생쥐의 생식계에 나타나는 변화를 확인하였다. 체중과 전반적인 장기 무게가 4주차에서 변화가 일어난 경우에도 12주차에는 상당 부분 정상으로 회복하는 경향을 보였는데, 이는 새로운 생체 리듬과 항상성에 대한 적응으로 사료된다. 부속생식기관인 저정낭과 전립선에서 전반적인 무게 감소 효과는 일주기 교란이 수컷 생쥐의 생식기능 저하를 초래할 가능성을 시사한다.

혈액 정소 장벽은 정소내에 있는 세정관과 Sertoli cell 사이에 존재하는 물리적 장벽이고, 혈액 부정소 장벽은 부정소 내의 상피세포간의 밀착결합에 의한 장벽이다. 이러한 혈액 정소 장벽과 혈액 부정소 장벽은 내강과 외부 사이의 물질수송에 관여하는 역할을 한다. 정소와 부정소에서는 정자의 형성과 성숙이 일어나기 때문에 이러한 장벽을 통한 물질수송의 조절은 정자의 형성과 성숙에 영향을 미친다. 본 연구에서는 Lipopolysaccharide(LPS)를 투여하여 전신성 염증반응을 일으킴으로서 염증반응에 의한 혈액정소장벽과 혈액부정소장벽의 분자적인 변화와 확산장벽기능의 변화를 조사하였다. 생후 8주령 생쥐에 LPS와 식염수를 각각 투여 후 24시간 뒤 정소 및 부정소를 적출하여 무게측정 뒤 정량적 realtime RT-PCR 방법을 통해 혈액정소장벽과 혈액부정소 장벽 현성에 관여하는 밀착결합 유전자(CAR, Claudins, JAMs, Occludin, Tricellulin, ZO-1) mRNA와 단백질 발현을 분석하였다. 실험군과 대조군에서 적출한 정소와 부정소의 무게를 측정하여 평균을 낸 결과, 무게가 유의적으로 증가하였다. 염증반응의 여부를 확인하기 위하여 TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-18의 mRNA를 realtime RT-PCR로 분석한 결과, TNF-α와 IL-5의 발현이 유의적으로 증가하였다. 정소에서 밀착결합 유전자의 realtime RT-PCR 결과, Cldn 1, 2, 4 mRNA의 발현은 대조군보다 LPS를 복강주사한 실험군에서 유의적으로 증가하였다. JAM3 mRNA 발현은 유의적으로 증가하였고, Occludin과 ZO-1 mRNA 발현은 큰 차이를 보이지 않았다. CAR의 경우, isoform 중 Exon 7번이 마지막인 long form의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였고, Tricellulin의 경우, isoform 중 long form과 mid form의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였다. 부정소에서는 Claudin 유전자와 JAM 유전자중 대부분이 증가하는 양상을 띄었고, 그 중 Cldn5와 JAM2에서 유의적인 증가를 보였다. 부위별로 나눠 유전자 발현을 분석한 결과, 차이를 나타내는 유전자도 있었다. Cldn5 mRNA의 발현은 전체적으로는 유의적으로 증가했으나 부정소 미부에서는 유의적으로 감소하였다. LPS투여군이 대조군보다 밀착결합 유전자 대부분에서 증가하는 양상을 나타내었고 일부는 유의적으로 증가하였다. 면역조직화학법으로 염색한 결과, Cldn1, 4, JAM3, Tricellulin의 경우 발색정도가 증가하였고, CAR의 경우 감소하였다. Biotin tracer를 통해 BTB의 투과성을 확인해본 결과, 대조군에서는 BTB에 막혀서 Sertoli cell 사이로 통과하지 못하였으나, LPS를 투여한 군에서는 BTB를 통과하여 감수분열 중인 정모세포 부근까지 확산되었다. 따라서 정소와 부정소에서 염증반응이 일어나게 되면 혈액정소장벽과 혈액부정 소장벽을 형성하는 밀착결합의 분자적 구조 변화를 초래하고, 이는 확산장벽의 변화시킴으로서 정자 형성과 성숙에 영향을 주어 남성 생식기능에 영향을 미칠 것으로 예측된다.

DEHP(di-ethylhexyl phthalate)는 가장 널리 쓰이는 플라스틱 가소제로서 인체노출 빈도가 매우 높은 내분비계장애물질이다. 본 연구는 임신기와 수유기 동안의 DEHP 노출이 후세대 생쥐 암컷 난소 및 난자에 미치는 영향을 알아보기 위한 목적으로 난소의 기능유전체 발현 변동을 조사하고, 유전자 발현 결과를 토대로 새로운 생식독성 마커를 발굴하고자 하였다. DEPH를 임신(GD) 1일째부터 수유기에 해당하는 출생 후(PND) 20일까지 모체에 0, 1.5 mg/kg/day 농도로 경구투를 한 후, F1 암컷의 난소 RNA를 추출하여 microarray 분석을 수행하였다. Expression Console software version1.1을 이용하여 발현변화가 나타난 유전자 정보를 획득하였다. 대조군과 1.5 mg/kg/day 처리군의 난소조직의 microarray 분석 결과, 약 120여 개의 유의적인 차이를 나타내는 유전자 정보를 확보하였으며, 특히 골지체에 존재하는 당전이효소인 fucosyltransferase 11(FUT11)이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 난소 내 FUT11의 발현 양상을 확인하기 위하여 발정주기에 따른 난소 FUT11 발현, 과배란을 유도한 후 난포 성숙과정에서의 FUT11 mRNA 및 단백질 발현 변화를 분석하였다. 발정주기에 따른 난소 조직에서의 FUT11발현은 발정기시기에 가장 높았으며, granulosa luteal cell, oocyte, interstitium에서 FUT11 단백질 발현이 확인되었다. 과배란을 유도한 난소조직에서는 PMSG 46 h 째에서 FUT11의 발현이 가장 높았다. DEHP는 임신기 및 수유기를 통해 장기간 노출될 경우 후세대 암컷의 난소기능 및 난자에 기능적 문제를 야기한다. FUT11은 인체질병 발생시 비정상적인 당잔기의 합성에 관련이 있을 것으로 보고된 바 있다. 실제로 암 조직이나 염증부위의 단백질 및 당지질의 당쇄부위에 fucosylation이 증가한다. 본 연구 결과에서 DEHP의 장기 노출이 후세대 암컷 생쥐 난소내 FUT11 발현을 증가시켜 난소 내 granulosa luteal cell, interstitium, oocyte에서 생성되는 단백질의 당쇄구조의 비정상적인 fucosylation을 유발함으로서 난소의 내분비기능과 및 난자성장 및 성숙에 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다.

남성의 체내에 미량의 estrogen이 존재하며, 정소와 부정소에 estrogen receptor(ERα, β)가 발현한다. Estrogen은 estrogen receptor를 통한 signaling을 통해 기능을 수행한다. 본 연구에서는 출생직후, 생후 1, 2, 4, 8주령의 생쥐 정소 및 부정소를 획득한 후 정량적 RT-PCR, Western blot, 면역조직화학법, image analysis를 통해 ERα의 발현을 분석하였다. 생쥐의 주령별 정소에서 ERα mRNA의 발현분석 결과, 정소에서는 신생부터 1주령까지 발현량이 급격히 증가하였으며, 4주령부터 약간 감소하였다. Western blot 결과, 출생 직후부터 생후 7일까지 급격히 증가하였고, 14일까지 높은 수준으로 발현하다가 이후 감소하였다. 면역조직화학법을 통한 ERα의 발현부위분석 결과, 정소에서 ERα 단백질은 주로 leydig cell과 peritubular cell에서 발현하였다. Image analysis를 통한 ERα 발현의 양적분석 결과, leydig cell에서 ERα는 출생 직후에 낮게 발현하다가 7일까지 급격히 증가하였고, 14일까지 높은 발현량을 유지하다가 이후 감소하였다. 이는 발생단계에 따른 남성호르몬 농도와 상반되는 결과로서, ERα의 발현이 leydig cell의 증식과 남성호르몬의 생성을 억제하는 것으로 추측할 수 있다. Peritubular cell에서 ERα는 출생 직후부터 생후 14일까지 꾸준히 증가하다가 이후에 급격히 감소하였다. ERα는 peritubular cell의 증식에도 관여하는 것으로 사료되며, 발생단계에서 leydig cell에 비해 peritubular cell의 증식이 먼저 완료되는 것으로 사료된다. 이를 종합하면, ERα는 정소에서 스테로이드형성 및 leydig cell/peritubular cell의 증식에 관여할 것으로 사료된다.

정상 발정주기를 보이는 7주령부터 38주령의 생쥐를 대상으로 발정주기에 따른 자궁조직내 비만세포의 분포를 toluidine blue 염색법으로 조사하였다. 비만세포의 밀도는 생쥐의 연령 증가와 더불어 지속적으로 증가하다가, 30주령 이후 감소하는 경향을 보였다. 발정주기별 분포에서는 조사한 모든 연령의 생쥐에서 발정후기에 가장 높은 밀도를 나타내었고, 그 대부분은 자궁근층에서 발견되었다. 10주령의 생쥐를 대상으로 Alcian blue-safranin

본 연구는 선형가속기의 고에너지 엑스선을 조사한 생쥐 간에 대한 백삼과 동충하초의 방사선방호효과를 연구하였다. ICR계 수컷생쥐 군에 7일 동안에 경구적으로 백삼(150 mg/kg/day)과 동충하초(200 mg/kg/day)를 각각 방사선조사 전에 투여했고 다른 생쥐 군에 5 Gy(1.01 Gy/min)의 방사선량으로 전신조사를 했고 대조군에 생리적 식염수 (0.1 ml)를 투여 한 후 간 조직에서 환원형 글루타치온(GSH)과 산화형 글루타치온(GSSG)의 함량을 각각 검사하였다. 그 결과 방사선조사군(Rad)보다 동충하초투여군(EF+Rad)과 백삼투여군(WG+Rad)에서 환원형 글루타치온 (GSH)함량이 유의성 있게 증가했으나 산화형 글루타치온(GSSG)의 함량은 유의성 있게 감소하였다. 총 환원형 글루타치온(total GSH)과 산화형 글루타치온(GSSG)의 함량 비율은 방사선조사군(Rad)보다 동충하초투여군(EF+Rad)과백삼투여군(WG+Rad)에서 유의성 있게 감소하였다.

시상하부에서 생성되는 nesfatin-1/NUCB2가 음식물 섭취와 에너지 대사를 조절한다는 것이 보고된 이후로, 최근 생쥐의 난소와 자궁에서도 다량의 nesfatin-1/NUCB2가 발현된다는 사실이 새롭게 밝혀졌다. 그러나 생식기관에서 nesfatin-1/NUCB2 발현이 어떻게 조절되는지는 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 생쥐의 생식기관 중 자궁에서 nesfatin-1/NUCB2 발현이 어떠한 경로를 통하여 조절되는지를 알아보고자 난소를

Aquaporins (AQPs)는 수분통로단백질로서 세포막에서 수분 또는 글리세롤의 수동수송에 관여한다. 현재까지 13종의 AQPs (AQP0-12)가 알려져 있으며, 이 중 AQP9은 수분통로뿐만 아니라 선택적 중성용질통로로도 작동한다. 정소에서 AQP9은 Leydig cell에서 발현하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 정소에서 AQP9의 역할을 알아보기 위해 생쥐 정소에서 생후 발달에 따른 AQP9의 발현과 human chorionic gonadotropin (hCG)에 의한 조절에 대하여 조사하였다. 생쥐 정소에서 AQP9 mRNA와 단백질은 2주령부터 발현하였고, 4주령부터 발현량이 급격히 증가하였다. Laser captured microdissection (LCM)을 이용하여 interstitial cell에서 AQP9 mRNA 발현을 분석한 결과, 1주령까지 낮은 발현을 보였고, 이후 발현량이 점진적으로 증가하였다. Immunohistochemistry로 AQP9을 염색한 후 quantitative image analysis를 시행한 결과, 2주령까지 Leydig cell에서 약한 immunoreactivity를 보이다가 4주령부터 세포 크기의 증가와 함께 강한 immunoreactivity를 보였다. Double immunofluorescence로 AQP9과 3β-HSD를 염색한 결과, 미성숙 정소에 비해 성체 정소의 Leydig cell에서 immunoreactivity가 유의적으로 증가하였다. 3주령 수컷 생쥐에 hCG를 주사한 후 정소에서 AQP9 mRNA 발현을 분석한 결과, 발현량이 증가하였으며, adult Leydig cells primary culture를 진행하면서 hCG를 처리한 결과, steroidogenic enzyme 유전자들의 mRNA 발현이 증가하면서 AQP9 mRNA 발현도 증가하였다. 따라서 Leydig cell에서 AQP9은 luteinizing hormone (LH)에 의해 조절되어 수분 및 중성용질을 수송함으로써 steroidogenesis 과정에서 세포 부피의 조절에 관여하는 것으로 사료된다. 흰쥐를 이용한 선행연구들과는 달리 본 연구에서는 세정관내에서도 AQP9이 발현하는 것을 확인하였다. 정소 내 세정관을 분리하여 AQP9 mRNA 발현을 분석한 결과, 2주령부터 mRNA가 발현하는 것이 확인되었고, 이후 발현량이 점진적으로 증가하였다. 또한 LCM을 이용하여 성체 정소의 세정관에서 AQP9 mRNA가 발현하는 것을 확인하였다. Double immunofluorescence로 AQP9과 claudin-11을 염색한 결과, Sertoli cell들간의 밀착결합 (tight junction)에서 함께 발현하는 것을 확인하였다. 따라서 Sertoli cells 사이의 AQP9은 수분 및 중성용질의 통로로 작동하여 이들이 혈액정소장벽 (blood testis barier)을 통과할 수 있게 하는 것으로 사료된다.

Txnip는 Thioredoxin (Trx)과 결합하여 그 기능을 억제함으로써 세포 내의 산화환원 환경을 조절하고, Txnip를 과발현시키면 Trx와는 독립적으로 glucose uptake와 lactate output을 억제한다고 알려져 있지만, 난자 내에서의 역할은 아직 밝혀진 바가 없다. 따라서 본 연구는 RNA interference (RNAi)를 이용하여 난자 내의 Txnip의 발현을 효과적으로 억제하고, Txnip가 생쥐 난자 성숙에 미치는 영향을 알아보고자 수행하였다. ICR 생쥐에 PMSG를 주사하고 44시간 후에 cumulus-oocyte complex(COC)형태의 GV 난자를 채취하였다. Cumulus cell을 물리적으로 제거한 후 Txnip dsRNA를 GV난자의 세포질 내에 미세 주입하여 Txnip RNAi를 수행하였다. 0.2mM IBMX가 첨가된 M16 배양액에서 24시간 배양 후 plain M16 배양액에서 16시간 배양하면서 난자의 성숙율과 표현형을 관찰하고, 염색체와 spindle의 모양은 immunofluorescence staining으로 동시에 관찰하였다. Time-Lapse imaging으로 cytoplasmic streaming, polar body emission 등의 표현형 및 시간차 등을 비교하였다. Txnip RNAi 결과, Txnip RNAi 된 난자는 MI 단계에서 정지하는 표현형을 보였고, 세포질이 응축되고, 난자 중심부에 spindle과 염색체가 분리되지 않은 상태로 뭉쳐서 존재함을 관찰하였다. IBMX 배양액 안에서 Txnip knockdown이 시작될 때 이미 난자의 세포질 안에 과립형성이 증가하고 cytoplasmic streaming이 어려워지는 것을 관찰하였으며, 세포질의 rigidity가 증가하는 것을 관찰하였다. Txnip은 lactate의 생산을 억제하기 때문에 Txnip 발현을 억제시키면 반대로 세포 내 lactate 생산이 증가된다고 알려져 있어, 본 연구진은 lactate의 농도를 높인 배양액에서 난자를 배양하였다. 이 때 시간이 지날수록 난자의 중심부에 과립이 형성되는 현상 즉, Txnip RNAi를 수행한 난자에서 나타나는 현상과 유사한 표현형을 확인하였다. 따라서 Txnip가 난자 성숙과정에서 lactate의 생성과 관련하여 작용할 것이라는 가설을 세우고, 따라서 Txnip의 감소로 증가된 lactate로 인해 glycogen granule이 과형성되고, 그 결과 cytoplasmic streaming이 현저히 줄어들면서 spindle과 염색체의 이동이 방해되는 것으로 추측된다. 이번 연구를 통해서 생쥐 난자의 포도당 대사와 Txnip의 연관성을 알 수 있었고, 이는 생쥐 난자의 대사적 조절기전과 난자 성숙과의 연관 관계를 규명하는데 중요한 역할을 할 것이라고 사료된다.

포유동물 생식세포를 생산하는 정자형성과정은 정원줄기세포 (spermatogonial stem cells, SSCs)가 일생 동안 정소 내 기저부에 존재하면서 계속적인 증식을 통해 그 수를 유지하고, 그 중 일부가 감수분열에 진입하여 남성생식세포인 정자를 생산하는 일련의 과정이다. 신생 및 성체의 정원줄기세포는 의학과 접목하여 불임 및 저출산 치료에 크게 기여할 것으로 사료되어, 이미 많은 연구자에 의하여 활발히 연구가 진행되고 있다. 그러나 이중 성체 정소 유래의 정원줄기세포는 신생 정소에 비하여 체세포당 비율이 매우 낮아 이를 분리하여 배양하기 위해서는 효율 높은 정원줄기세포의 분리 방법의 개발이 필요하다. 따라서 본 연구는 인간에 적용하기에 가장 적합하다고 생각되는 조직이식 방법을 통하여 성체 생쥐의 정원줄기세포를 과밀화하고, 이렇게 얻어진 세포를 체외에서 배양하고자 하였다. 6～8주령의 정상적인 정자형성과정이 일어나고 있는 성체 생쥐 (BDF1)의 정소를 분리하였고, 정소 내 존재하는 분화된 생식세포를 줄여주기 위하여 면역이 결핍된 누드마우스의 등쪽에 이식하였다. 이때 생착효율을 알아보기 위하여 실험군은 3개 (whole testis under dorsal skin, slice testis under dorsal skin and whole testis in the abdominal cavity)의 그룹으로 나누어 이식하였다. 이식 2～4주 후 이식한 정소 조직을 채취하여 일부는 기존의 방법 (정소 조직의 이식방법을 사용하지 않은 대조군)과 비교해서 조직이식을 시행 후 세정관내 존재하는 정원줄기세포의 비율을 조직화학적 방법으로 비교 분석하였다. 나머지 조직은 개개의 세포로 분리하여 정원줄기세포의 증식 및 유지에 필요한 성장인자 (GDNF, bFGF, LIF, EGF, IGF-1)를 첨가한 후 배양하였으며, 7～10일마다 계대배양하였다. 배양된 세포는 RT-PCR, AP staining, TUNEL staining, Immunocytochemistry 및 FACS analysis를 통하여 정원줄기세포 특징을 분석하였다. 이식 2주 후 3그룹 내 정원줄기세포가 포함되어 있는 비율은 각각 93% (13/14), 92% (12/13), 57% (4/7)로 나타났으며, 이식된 조직의 seminiferous tubules내에는 분화된 생식세포가 사라지거나 퇴화된 것을 확인하였다. TUNEL assays를 통하여 Whole과 Sliced testis 그룹에서는 7.3±3.3%과 8.3±3.9% 만이 세포사가 진행되는 세포를 관찰한대 반하여 Abdominal cavity에 이식한 군에서는 70.9±16.2%로 매우 높은 세포사율을 관찰하였다. 체외배양 기간 동안 정원줄기세포의 colonization 효율은 이식하지 않은 대조군에 비하여 높게 관찰하였다. 조직 이식 후 배양한 성체 유래 정원줄기세포는 위 성장인자가 포함된 배양액에서 2.5달 (8계대) 동안 성공적으로 유지 배양되었다. 배양된 세포는 정원줄기세포의 특징인 AP activity를 강하게 나타냈으며, 표지인자인 Thy-1와 GFRα-1 또한 강하게 발현되는 것을 FACS와 Immunocytochemistry를 통하여 확인하였다. 또한 RT-PCR를 통하여 정원줄기세포 표지유전자 마커인 integrin β1, mvh, ngn3 mRNA는 강하게 발현되는데 비하여 생식세포 분화유전자 마커인 piwil2, stra8, c-kit, TH2B and TP-1 mRNA는 발현되지 않거나 약하게 발현되었다. 조직이식을 통하여 성체 내 존재하는 극소수의 성체 정원줄기세포의 분리 및 배양이 가능함을 확인하였다. 이러한 생쥐 모델 시스템을 인간에게 적용할 경우 autologous한 조직이식을 통해 단순화된 방법으로 정원줄기세포 분리 및 배양이 가능할 것으로 사료된다.

Prostaglandin D2 (PGD2)는 배아의 성결정 단계에서 Sertoli cell 분화의 주요인자인 SOX9의 발현을 촉진한다. PGD2는 Prostaglandin D synthase (PGDS)에 의해 Prostaglandin H2 (PGH2)가 이성화되어 만들어진다. PGDS는 스테로이드 생성 관련 유전자인 3β-HSDⅥ, 17β-HSDⅢ와 함께 Leydig cell에서 사춘기 이후 발현되는 것으로 알려져 있으며, lipocalin-type PGDS (L-PGDS)와 hematopoietic PGDS (hPGDS)가 있는 것으로 알려져 있다. L-PGDS는 수컷특이적인 효소로 알려져 있으나, hPGDS는 수컷의 생식소에서는 그 기능이 알려져 있지 않다. 또한, L-PGDS는 여러 조직에서 estrogen에 의해 조절된다고 알려져 있으나, 정소에서는 정확한 조절양상이 알려져 있지 않다. 본 연구는 정소내에서 정자형성 및 스테로이드 생성과정에서 두 가지 형태의 PGDS에서 생성된 각각의 PGD2의 역할을 규명하기 위한 일환으로 생쥐 정소 발생과 성숙단계에 따른 PGDS와 PGD receptor 및 GPR44의 발현을 조사하였으며, estrogen에 의한 PGD2 system의 조절양상을 규명하기 위해 ERα KO와 WT 생쥐에서의 L-PGDS, hPGDS, PGD receptor, GPR44의 발현을 조사하였다. 생후 1, 7, 14, 28, 56일령 생쥐 정소 및 ERα KO와 WT 생쥐 정소로부터 total RNA를 추출하여 정량적 RT-PCR법으로 L-PGDS, hPGDS, PGDR, GPR44의 mRNA 발현을 분석하였고, 정소 파라핀 절편에서 면역조직화학방법으로 L-PGDS, hPGDS, PGDR, GPR44의 단백질 발현을 분석하였다. ERα KO와 WT생쥐 정소 파라핀 절편에서 면역조직화학법을 통해 L-PGDS의 단백질 발현 정도를 분석하였다. 생쥐 정소에서 hPGDS, L-PGDS, GPR44, PGDR의 mRNA 모두 사춘기(생후 28일)이후 발현이 유의적으로 증가하였다. GPR44와 PGDR의 mRNA는 사춘기 이전에는 거의 발현되지 않았다. 하지만 L-PGDS의 경우는 생후 7일, 14일에 비해 생후 1일에서 높은 mRNA 발현량을 보였다. ERα KO와 WT 생쥐 정소 mRNA의 경우 hPGDS와 PGR에서는 차이를 보이지 않았으나 L-PGDS와 GPR44에서는 WT 생쥐보다 ERα KO 생쥐에서 낮은 발현량을 보였다. 면역조직화학법 결과, L-PGDS와 hPGDS는 생후 1일의 fetal Leydig cell에서 주로 발현하였으며, 사춘기 이후 adult Leydig cell에서 발현하였다. GPR44는 Sertoli cell에서 발현되며, 신생기에는 Spermatogonia에, 사춘기에는 elongating spermatid와 round spermatid에, 성체기에는 Leydig cell에서도 발현된다. PGDR은 생후 1일에서 Sertoli cell에서 발현되고, 사춘기와 성체기의 Sertoli cell과 Leydig cell에서 발현된다. 그리고 ERα KO 생쥐에서 L-PGDS는 WT 생쥐보다 낮은 단백질 발현량을 보였다. L-PGDS와 hPGDS는 fetal 및 adult Leydig cell에서 발현되므로 PGD2는 Leydig cell에서 발현되는 PGDR을 통해 Leydig cell의 분화 및 스테로이드 형성과정에 관여하는 것으로 사료된다. 또한 PGD2는 Sertoli cell과 germ cell에서 발현되는 GPR44를 통해 정자형성과정에 관여하는 것으로 사료된다. 그리고 estrogen에 의해 L-PGDS와 GPR44의 mRNA가 발현량이 증가하는 방향으로 조절되고, 그로 인한 단백질 발현 또한 증가하는 방향으로 조절되는 것으로 사료된다.

남성의 체내에 미량의 estrogen이 존재하며, 정소와 부정소에 estrogen receptor (ERα, β)가 발현한다. Estrogen은 ERα와 ERβ를 통해 세포의 생존, 증식 및 분화를 조절한다. ERα는 정소에서 스테로이드형성, 정자형성 부정소에서 정자 성숙 및 부정소 체액항상성 조절기능을 수행할 것으로 추측된다. 본 연구에서는 출생 직후, 생후 1, 2, 4, 8주령의 생쥐 정소 및 부정소를 획득한 후 정량적 RT-PCR, Western blot, 면역조직화학법을 이용하여 ERα의 발현을 확인하였다. 생쥐의 주령별 정소와 부정소에서 ERα mRNA의 발현분석 결과, 정소에서는 신생부터 1주령까지 발현량이 급격히 증가하였으며 4주령부터 약간 감소하였다. 부정소에서는 신생부터 4주령까지 비슷한 발현량을 보였으며, 8주령에서 발현량이 증가하였다. Western blot 결과, 8주령 부정소에서 efferent duct에서 가장 강하게 발현하였고, 부정소 체부에서 가장 적게 발현되었다. 면역조직화학법을 통한 ERα의 발현부위분석 결과, 정소에서 ERα 단백질은 주로 Leydig cell과 peritubular cell에서 발현하였다. 부정소에서는 efferent duct와 두부 부정소에서 가장 강하게 발현되었으며, 두부 부정소의 principal cell과 narrow cell에서 강하게 발현되었다. 체부 부정소에서는 basal cell과 clear cell에서 발현하였다. 미부부정소에서는 stromal cell에서 강하게 발현하였고, basal cell과 clear cell에서도 발현되었다. ERα는 정소에서 스테로이드형성 및 Leydig cell의 증식에 관여하며, 부정소에서 정자의 성숙 및 저장에 관여할 것으로 사료된다.

최근 시상하부에서 생성되는 nesfatin-1/NUCB2가 섭식과 에너지 대사를 조절한다는 사실이 새롭게 밝혀졌다. 본 연구에서는 이러한 단백질이 생쥐의 생식기관에서도 발현을 하는지, 그리고 그 수용체가 생식기관 내에 존재하는 지를 확인함으로써 nesfatin-1이 생식기능에 미칠 수 있는 가능성을 알아보고자 하였다. 암컷 생쥐에서 난소와 자궁을 획득하여 conventional PCR 방법으로 NUCB2 mRNA 발현을 조사하였고, real-time PCR 방법으로 상대적인 NUCB2 mRNA 발현량을 비교 분석하였다. 난소 내 nesfatin-1 단백질의 발현 위치를 조사하기 위하여 nesfatin-1 항체를 이용한 면역조직화학염색법을 수행하였으며, biotin conjugated nesfatin-1을 이용하여 nesfatin-1 결합 부위를 확인하였다. 또한 생식소 내 NUCB2 mRNA 발현이 성선자극호르몬에 의해 영향을 받는지 알아보기 위해 PMSG 투여 후 NUCB2 mRNA 발현량을 조사하였다. 실험 결과, 생쥐의 난소와 자궁에서 확인된 NUCB2 유전자가 시상하부에서 만큼이나 많은 양이 발현되고 있었다. 면역조직화학적 염색 결과, nesfatin-1 단백질은 협막세포와 대부분의 기질세포에서 발현되었고, 일부 황체세포에서도 발현이 확인되었다. 반면, 난포 내 과립세포에서는 발현되지 않았으나, 특정 난포 내 난자에서는 발현됨을 확인하였다. 한편, nesfatin-1 단백질의 결합 부위는 난소 백막 주위의 기질세포와 협막세포에서 관찰되었다. 또한 PMSG 투여 후 난소와 자궁에서 NUCB2 mRNA의 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다. 이상의 결과에서 난소 내 nesfatin-1 단백질의 발현과 그 결합 부위의 존재는 nesfatin-1이 뇌에서 뿐만 아니라 생식기관에서도 국부조절인자로써 중요한 역할을 할 것으로 사료되며, 앞으로 생식기관에 미치는 nesfatin-1의 역할을규명하기위한더많은연구가필요하다고판단된다.

DNA 메틸화 (DNA methylation)는 유전자의 발현을 조절하는 대표적인 후생학적 조절기작 (epigenetic regulation) 중에 하나이다. DNA 메틸화 양상은 생식세포 형성과정 및 배 발생단계에서 탈메틸화 (demethylation)와 de novo 메틸화의 드라마틱한 변화가 일어난다. 또한 이러한 DNA 메틸화는 배아줄기세포 (embryonic stem cells, ESCs)에서 특징적인 양상을 보이는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 생쥐 수정란 유래 배아줄기세포와 체세포핵이식 배아줄기세포 (nuclear transplanted ESCs)를 이용해서 대표적 각인유전자 (imprinting genes)로 알려진 Snrpn, Igf2r, H19 유전자들에 대한 메틸화 양상을 알아보고자 하였다. 연구 결과 H19 유전자에 대해서는 DNA 메틸화 양상은 수정란 유래 배아줄기세포와 체세포핵이식 배아줄기세포에서 비슷한 경향을 보였으나, Snrpn과 Igf2r의 경우에는 체세포핵이식 배아줄기세포에서 과메틸화 (hypermethylation) 경향을 보였다.

배아줄기세포를 이용한 형질전환동물의 제조는 유전자의 기능 연구에 필수적이다. 특히 유전자 파괴 생쥐는 유전자의 기능 연구뿐만 아니라 사람 질병 연구에 중요한 모델이 되어 왔다. 유전자 적중법(gene targeting)과 유전자 함정법(gene trapping)은 ES 세포에서 녹아웃(knockout) 생쥐를 제조하는 대표적인 방법이다. 20여 년 전 유전자 적중법과 함정법이 최초로 개발된 이후에 이 기술은 많은 변화를 거쳤다. 특히 상동재조합에 기초한 전통적 유전자 적중법은 대량 제조기반의 조건부 유전자 적중법의 개발로 이어졌고, 유전자 적중법 및 유전자 함정법의 장점 요소의 조합은 유전자를 파괴하는 범위를 넓혔고, 유전자 적중을 더욱 효율적으로 만들었다. 이런 기술은 특정 유전자를 표적으로 하는 다양한 종류의 돌연변이 형질전환동물을 제조할 수 있게 하여 포스트게놈 시대에 요구되는 전체 유전체의 기능 연구를 더욱 효과적으로 진행시켜 줄 것이다.

부정소 상피세포에서 형성되는 밀착결합 (Tight Junction, TJ)은 혈액-부정소장벽 (blood-epididymal barrier, BEB)을 형성하여 이온과 저분자물질의 이동을 제한하여 수분항상성에 기여하며, 정자의 성숙환경을 제공한다. TJ는 세포질 내부로 세포질골격 및 다양한 신호전달 분자와 복합체를 형성하고 있으므로 다양한 세포 내외부의 신호에 반응하여 그 구조와 기능이 역동적으로 조절된다. 정소와 부정소에 estrogen receptor (ERα, β)가 발현하며, 부정소에 비교적 높은 농도로 존재하는 estrogen은 부정소 체액항상성 조절에 관여하는 것으로 알려졌다. 본 연구에서는 estrogen에 의한 부정소 관강내 정자성숙 환경조성 기작 규명의 일환으로 ERαKO (ERα－/－) 생쥐의 부정소에서 TJ 발현을 비교분석하였다. 5개월령 ERαKO 생쥐의 부정소를 획득하여 무게측정 및 조직학적 분석을 시행하였다. 또한, 부정소를 각 부위별 (두부, 체부, 미부)로 나누어 RT-PCR 및 면역조직화학법으로 밀착결합 유전자인 claudins (-1, -2, -3, -4, -5, -11), occludin, JAMs (-1, -2, -3), CAR, tricellulin 발현을 분석하였다. WT에 비해 ERαKO 생쥐 부정소의 무게는 유의적으로 감소하였고, 정자형성 장애로 인해 부정소 내부에는 정자가 관찰되지 않았다. 또한 efferent duct 내강이 팽태되었다. ERαKO 생쥐 두부 부정소의 경우 cla-1, JAM-1, occludin, tricellulin mRNA 발현이 유의적으로 감소하였고, cla-11 mRNA는 감소하는 경향을 나타냈으나 유의성은 없었다. 체부 부정소는 TJ 유전자 발현에 큰 변화를 나타내지 않았으며, 미부 부정소에서는 cla-5, JAM-1, -3 mRNA 발현이 증가하는 경향을 나타냈으나 유의성은 없었다. 면역조직화학적 분석결과, cla-1은 principal cell의 세포질에서 강하게 발현하였으며, cla-11은 interstitium에서 주로 발현하였고, WT과 ERαKO 간에 유의적인 차이가 나타나지 않았다. Occludin은 initial segment의 상피세포 apical 부분에서 주로 발현하였고, efferent duct에서 WT에 비해 강하게 발현하였다. JAM-1은 ERαKO의 두부 부정소에서 principal cell의 apical 부위에서 발현이 감소하였다. 부정소 두부와 미부에서 estrogen은 ERα를 경유하여 TJ 유전자 발현을 조절함으로서 정자성숙과 저장환경 조성에 작용하는 것으로 사료된다.

부정소 상피세포에 존재하는 Tight junctions (TJs)는 물질 확산장벽으로 작동하며, 혈액-부정소 장벽 (blood-epididymal barrier, BEB)을 형성한다. 본 연구는 부정소 TJ 발현에 미치는 정소액의 영향을 확인하고자 수출관 결찰 (effrent duct ligation, EDL) 생쥐 부정소에서 TJ 유전자 발현변동을 조사하였다. 생후 8주령 생쥐를 정소수출관 결찰을 시행, 15일 후 부정소를 획득하여 정량적 RT-PCR법으로 TJs 유전자의 mRNA 발현을 분석, 면역조직화학법으로 단백질 발현 변화를 분석하였다. 수출관 결찰결과 EDL 부정소 중량은 감소하였고, initial segment 상피세포의 두께가 얇아졌다. EDL 부정소 두부에서 claudin-1, -11, JAM-3 mRNA 발현이 증가하였고, claudin-2 mRNA 발현은 감소하였다. 체부에서는 claudin-1, -3, -11, JAM-1, -3, tricellulin mRNA 발현이 증가하였고, tricellulin은 미부에서 mRNA 발현이 증가하였다. 면역조직화학적 분석결과, EDL 부정소 initial segment에서 claudin-2 발현이 감소하였다. CAR는 두부에서 발현이 감소하나 체부와 미부에서 증가하였다. JAM-1은 체부와 미부의 상피세포 내 발현이 증가하였다. 수출관 결찰시 initial segment TJ 조성에 많은 변화가 유발되었다. 부정소상피의 밀착결합은 정소기원의 생물학적 활성인자들의 영향하에 조절되는 것으로 사료된다.

부정소 상피세포에서 형성되는 밀착결합 (Tight junction, TJ)은 혈액-부정소장벽을 형성하여 정자의 수송, 저장 및 성숙에 필요한 부정소 내부환경을 조성한다. TJ는 occludin, claudins, JAMs, CAR, tricellulin 등의 integral membrane protein과 ZO-1 등의 plaque protein으로 구성된다. 한편, 정관결찰(Vasectomy)은 부정소 관강 내 삼투압 및 상피세포에서 분비되는 단백질조성을 변화시키며, 항정자항체의 형성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 정관결찰에 따른 부정소 관강 내 정자의 성숙 및 저장환경 변화를 규명할 목적으로 부정소 상피세포 TJ 유전자 발현을 조사하였다. 생후 1, 2, 4, 8주령 부정소를 사용하였다. 생후 8주령 생쥐에서는 부정소 두부, 체부, 미부 부위별로 절취하여 분석하였다. 8주령 생쥐에 정관결찰 시행 6주 후 부정소를 획득하여 해부조직학적 변화 유무를 확인 한 후 RT-PCR 및 면역조직화학법으로 claudins (-1, -2, -3, -4, -5 -11), occludin, JAMs (-1, -2, -3), CAR, tricellulin 발현 변화를 분석하였다. Cla-2 mRNA는 두부 부정소에서만 강하게 발현하였으며, Cla-1, JAM-2 mRNA는 체부 부정소에서 다른 부위보다 강하게 발현하였다. Cla-4 mRNA는 체부 부정소에서는 거의 발현하지 않았고 두부와 미부 부정소에서 발현하였다. Occludin mRNA는 두부와 체부 부정소에서 미부 부정소보다 많이 발현하였다. CAR mRNA는 두부 부정소에서 약간 강하게 발현하였다. Cla-1, JAM-2는 principal cell에서 주로 발현하였다. Occludin, JAM-1, CAR는 apical membrane에서 발현하였으며, tricellulin은 근육층에서 발현하였다. 정관결찰 후 부정소 중량이 증가하였고 체부와 미부 부정소관이 비후는 상피세포 두께의 감소와 근육층 비후를 동반하였다. 정관결찰 모델의 두부 부정소에서 밀착결합 유전자 중 cla-2, -3, -11, JAM-2, -3, tricellulin mRNA 발현이 증가하였다. 또한 체부 부정소에서는 cla-1, -3, -4, JAM-1, -2 mRNA, 미부 부정소에서는 JAM-3 mRNA의 발현이 증가하였다. 부정소 관강 내부 정자 성숙환경 조성에 관여하는 TJ 유전자 발현은 부정소 부위별로 차등적으로 발현됨을 확인하였다. 정관결찰에 의한 부정소 상피세포의 TJ 유전자 발현의 변화는 부정소 내부의 물리적 압력의 증가와 체액 삼투압의 변화에 따른 대응기작으로 사료된다. 또한 부정소 중량 증가와 부정소 체부와 미부의 해부조직학적 변화는 부정소 부위별 분절화 특성에 관여하는 상위의 유전자 조절네트웍의 변형을 암시하므로 이에 관여하는 유전체들에 대한 연구가 필요하다.